l******g
发帖数: 1623 | 1 怎么样证明一个protein可以self cleavage, 而不是其他的protease协助。这蛋白在体
内也是会cleaved，没人得到过full length的，文献上说是其他protease切的。我做的
recombinant, 无论真核还是大肠杆菌表达出来的，都不稳定，纯化出来的都是full
length 和 truncated 在一起。4度放放，过夜都会变成truncated. 我怀疑这蛋白自己
切了自己，不知道怎么证明。 | t****p
发帖数: 1504 | 2 找到关键domain的关键氨基酸，mutation？
【在 l******g 的大作中提到】
: 怎么样证明一个protein可以self cleavage, 而不是其他的protease协助。这蛋白在体
: 内也是会cleaved，没人得到过full length的，文献上说是其他protease切的。我做的
: recombinant, 无论真核还是大肠杆菌表达出来的，都不稳定，纯化出来的都是full
: length 和 truncated 在一起。4度放放，过夜都会变成truncated. 我怀疑这蛋白自己
: 切了自己，不知道怎么证明。
| s****t
发帖数: 461 | 3 30 years ago, some famous scientists faced the similar problem to yours.
Later, they solved the problem and their work got them Nobel price. Yes, I
am talking about RNA self splicing.
Unfortunately, you probably can't chemically synthesize your protein in full
-length. So it's almost impossible to get a truly clean system to demonstate
it.
Here are some suggestions:
1. Try in-vitro translation system to see if it's still the case.
2. If you can map the cleavage site, you can synthesize some peptide
covering that site and use it as competitive substates. Self-cleavage
reaction should be first-order or pseudo-first order reaction while enzyme-
catalyzed cleavage should be second-order reaction and can be competed out
in the presence of excess competitive substrates.
JMHO and comments are welcome. | s******y
发帖数: 28562 | 4 把那个蛋白两头联上不同的tag, 双重纯化得到全长的纯蛋白，然后在不同
温度，不同蛋白浓度和离子条件(such as with EDTA, with Mg, with Ca)
下观察是否会出现truncate.
然后再往后细化条件。
【在 l******g 的大作中提到】
: 怎么样证明一个protein可以self cleavage, 而不是其他的protease协助。这蛋白在体
: 内也是会cleaved，没人得到过full length的，文献上说是其他protease切的。我做的
: recombinant, 无论真核还是大肠杆菌表达出来的，都不稳定，纯化出来的都是full
: length 和 truncated 在一起。4度放放，过夜都会变成truncated. 我怀疑这蛋白自己
: 切了自己，不知道怎么证明。
| k******0
发帖数: 1073 | 5 Sunnyday说的方法好。
另一种可能，考虑纯化的样品有没有污染的protease。 | s*******e
发帖数: 1010 | 6 这恐怕不容易，他说了木有人能拿到全长的蛋白。
【在 s******y 的大作中提到】
: 把那个蛋白两头联上不同的tag, 双重纯化得到全长的纯蛋白，然后在不同
: 温度，不同蛋白浓度和离子条件(such as with EDTA, with Mg, with Ca)
: 下观察是否会出现truncate.
: 然后再往后细化条件。
| t****p
发帖数: 1504 | 7
【在 s******y 的大作中提到】
: 把那个蛋白两头联上不同的tag, 双重纯化得到全长的纯蛋白，然后在不同
: 温度，不同蛋白浓度和离子条件(such as with EDTA, with Mg, with Ca)
: 下观察是否会出现truncate.
: 然后再往后细化条件。
| s*******e
发帖数: 1010 | 8 你可以把你拿到的truncated蛋白送去做质谱吗？如果能确定降解的位点，做个突变可
能抑制你目标蛋白的降解（质谱测不出就根据分子量来猜，做个Ala scan）。如果能够
成功地拿到抗酶切的全长蛋白，可以把它当作成一个蛋白酶来测试，像三楼说的那样，
合成一些降解区域序列的多肽来检测你目的蛋白的蛋白酶活性。 | t****p
发帖数: 1504 | 9 往纯的方向做只能作为支持性的数据，很难完全把这个问题说干净（还是有看不到的成
分）。楼上说的in vitor translation更好一些。
【在 s******y 的大作中提到】
: 把那个蛋白两头联上不同的tag, 双重纯化得到全长的纯蛋白，然后在不同
: 温度，不同蛋白浓度和离子条件(such as with EDTA, with Mg, with Ca)
: 下观察是否会出现truncate.
: 然后再往后细化条件。
| y******8
发帖数: 1764 | 10 Purify under denaturing condition and renature the full length protein. | | | s******y
发帖数: 28562 | 11 in vitro translation 无法排除外源酶的作用。因为cell extract 里面有
不少蛋白酶是除不掉的。
【在 t****p 的大作中提到】
: 往纯的方向做只能作为支持性的数据，很难完全把这个问题说干净（还是有看不到的成
: 分）。楼上说的in vitor translation更好一些。
| s******y
发帖数: 28562 | 12 提纯不需要太长时间，应该没有问题，他也说了，提出来的是一个全长和
truncate 的 mixture ，放过夜之后才会变成truncate.
所以说明在一开始至少有一定比例是全长的，肯定是可以提出来的。
【在 s*******e 的大作中提到】
: 这恐怕不容易，他说了木有人能拿到全长的蛋白。
| s******y
发帖数: 28562 | 13 这也是一个办法，值得一试，但是不保险，因为很多蛋白没有办法复性。
不过生物这东西没有什么是100%保险的，不试不知道。
【在 y******8 的大作中提到】
: Purify under denaturing condition and renature the full length protein.
| l******g
发帖数: 1623 | 14 感谢各位的讨论, 挺有启发, 特别是思你特提的第二点,从酶动力学上动脑筋. 我早就
该找本酶学书来看了,以前学的都忘记了.
这蛋白我已经作的很纯了, load 5 微克,跑SDS-PAGE, 只有这蛋白和它切了的fragment
. cleavage site也map出来了, 作的N-term AA sequencing. 突变cleavage site不怎
么影响cleavage, 但突变离开这site几个AA的地方,有不被cleave的.
在E.coli里面表达出来是包含体里面, 纯化很简单, refolding后也会有cleavage, pH8
.5 比较抗降解. 最近作RP HPLC, load上柱前有90%左右intact, 下来后>90%都被降解
了. RP HPLC的buffer pH 4. 有没有什么protease是在酸性下活性高的? | s******y
发帖数: 28562 | 15 很多蛋白因为构型问题容易被自发水解。你这个会不会有这个因素在里面？
在酸性下活性高的酶很多啊，比方说很多lyosome 的酶就是。
fragment
pH8
【在 l******g 的大作中提到】
: 感谢各位的讨论, 挺有启发, 特别是思你特提的第二点,从酶动力学上动脑筋. 我早就
: 该找本酶学书来看了,以前学的都忘记了.
: 这蛋白我已经作的很纯了, load 5 微克,跑SDS-PAGE, 只有这蛋白和它切了的fragment
: . cleavage site也map出来了, 作的N-term AA sequencing. 突变cleavage site不怎
: 么影响cleavage, 但突变离开这site几个AA的地方,有不被cleave的.
: 在E.coli里面表达出来是包含体里面, 纯化很简单, refolding后也会有cleavage, pH8
: .5 比较抗降解. 最近作RP HPLC, load上柱前有90%左右intact, 下来后>90%都被降解
: 了. RP HPLC的buffer pH 4. 有没有什么protease是在酸性下活性高的?
| Z**S
发帖数: 1211 | 16 Is the cleavage metal dependent?
If yes, use EDTA to stop cleavage and look for conserved Asp and Glu;
if not, look for conserved His, Cys, Ser, Tyr.
If Zn+ is present, check if there are any conserved cysteines.
fragment
pH8
【在 l******g 的大作中提到】
: 感谢各位的讨论, 挺有启发, 特别是思你特提的第二点,从酶动力学上动脑筋. 我早就
: 该找本酶学书来看了,以前学的都忘记了.
: 这蛋白我已经作的很纯了, load 5 微克,跑SDS-PAGE, 只有这蛋白和它切了的fragment
: . cleavage site也map出来了, 作的N-term AA sequencing. 突变cleavage site不怎
: 么影响cleavage, 但突变离开这site几个AA的地方,有不被cleave的.
: 在E.coli里面表达出来是包含体里面, 纯化很简单, refolding后也会有cleavage, pH8
: .5 比较抗降解. 最近作RP HPLC, load上柱前有90%左右intact, 下来后>90%都被降解
: 了. RP HPLC的buffer pH 4. 有没有什么protease是在酸性下活性高的?
| l******g
发帖数: 1623 | 17 想过是不是hydrolysis, 我感觉自发hydrolysis是比较慢的反应, 今天作了个试验, 把
蛋白从pH8.5 稀释到pH4的buffer里, 5分钟内所有蛋白都变成truncated了
【在 s******y 的大作中提到】
: 很多蛋白因为构型问题容易被自发水解。你这个会不会有这个因素在里面？
: 在酸性下活性高的酶很多啊，比方说很多lyosome 的酶就是。
:
: fragment
: pH8
| l******g
发帖数: 1623 | 18 下面准备做做离子依赖的实验
【在 Z**S 的大作中提到】
: Is the cleavage metal dependent?
: If yes, use EDTA to stop cleavage and look for conserved Asp and Glu;
: if not, look for conserved His, Cys, Ser, Tyr.
: If Zn+ is present, check if there are any conserved cysteines.
:
: fragment
: pH8
| s******y
发帖数: 28562 | 19 啊？那确实很有可能是有酶活性了。
要排除外来酶的影响，还有一个办法，就是放进一些其他蛋白（比方说BSA）
如果这些放进去的蛋白丝毫不受影响，但就是你的那个蛋白被切的话，那非常
有可能真的是自切酶了。
【在 l******g 的大作中提到】
: 想过是不是hydrolysis, 我感觉自发hydrolysis是比较慢的反应, 今天作了个试验, 把
: 蛋白从pH8.5 稀释到pH4的buffer里, 5分钟内所有蛋白都变成truncated了
| k******0
发帖数: 1073 | 20 如果有protease活性，可以试一试各种抑制剂，看看属于哪类的酶，在制备中添加相应
的抑制剂。
印象中蛋白酶还是较容易被抑制的。 | | | D******9
发帖数: 2665 | 21 从ECOLI纯化的蛋白没有办法完全避免污染， 可以考虑做一个不同梯度的稀释试验，
然后看那两个蛋白的比率， 要是有外援蛋白酶污染， 经过稀释， 那个小蛋白的比例
应该会降低。 要是那个是自切， 比例应该不会大变 | g*****p
发帖数: 451 | 22 这个问题不难回答
从你以前的帖子已经知道你找到了酶被水解的位点
那你只需要合成一段相关的底物就可以了
然后还可以标记一下荧光，加点酶，看能不能切
要是能切的话，连kcat/km都可以算出来
如果能切，一般来说trans-leavage和cis-cleavage的认定才是
最头疼的事
一般来说得需要做个核磁或者晶体结构才行
要是你能拿到zymogen的结构呢，这个是比较好回答了
但你也说了这个酶不稳定，你想拿到zymogen的结构不做几个点突变把它稳定住
是不行的
不过现在为止你的实验数据有点让我困惑的地方（我不是说你的实验数据不对，只是说很
难解释这个现象，所以希望你先再确证一下）
1.你说4度放过夜，该酶都会变成truncated，这个和你开始express出来recombinant的
protease有两者混合的现象结合起来看，很难让我相信这个酶会有autocleavage的活性
因为要知道，ecoli表达重组蛋白，其细胞中的protease浓度是很高的。如果真的具有
自剪切活性，你根本不可能拿到full-length的protease,expression的时候就自己切光
了。因为你的诱导温度怎么着也是12~16度以上了，用这个温度induce，怎么也得过夜
才够吧，切割条件比你的4度过夜充分多了
所以从这一点来说，我认为你的酶估计也就是有一段区域不稳定，容易被水解而已
2.后来你又做了pH change的实验，5分钟最适pH导致完全降解。这个又说明完全是一个
pH
induced zymogen conformation change,使其自身酶活性加速
1和2是有点矛盾的，我解释不了
所以看看你还有点其他什么信息可以帮助推理的
如果硬要找个合理的解释，我只能说可能还是1，2是由于pH导致酶的构象变化，那段
loop区域暴露更彻底，更容易被水解。但是这个解释从一般的酶学研究历史来看，是很
罕见的
除非是你投个cns文章，碰到个烂人正好揪住这么个细枝末节的问题较劲，旁边又有人
跟你抢发，那就只能这么硬凹了，不过这个不提倡，不是正确的科研态度
【在 l******g 的大作中提到】
: 怎么样证明一个protein可以self cleavage, 而不是其他的protease协助。这蛋白在体
: 内也是会cleaved，没人得到过full length的，文献上说是其他protease切的。我做的
: recombinant, 无论真核还是大肠杆菌表达出来的，都不稳定，纯化出来的都是full
: length 和 truncated 在一起。4度放放，过夜都会变成truncated. 我怀疑这蛋白自己
: 切了自己，不知道怎么证明。
| l******g
发帖数: 1623 | 23 谢谢你的回复.
4度下过夜就truncated的蛋白是从CHO细胞里面表达出来的,分泌到细胞外面,纯化后大
部分是truncated,小部分是intact的. 放过夜intact的就没有了. 这个cell line如果
培养超过3天,基本上培养基里面intact的就非常少了(我估计是因为pH下降, 酶活性提
高的缘故). 后来才用E.coli来表达,形成包含体还是比较稳定的,只有作western才能看
到truncated. 在高pH下复性, 拿到的都是intact的.
如果合成一段多肽包含cleavage site, 和我的蛋白混一起,如果多肽能被降解,是不是
说明有其他protease存在? 我在药厂, 本来是要把这蛋白作个therapeutical 药物的,
现在希望不大, 上头不太可能同意花时间作结晶什么的.
【在 g*****p 的大作中提到】
: 这个问题不难回答
: 从你以前的帖子已经知道你找到了酶被水解的位点
: 那你只需要合成一段相关的底物就可以了
: 然后还可以标记一下荧光，加点酶，看能不能切
: 要是能切的话，连kcat/km都可以算出来
: 如果能切，一般来说trans-leavage和cis-cleavage的认定才是
: 最头疼的事
: 一般来说得需要做个核磁或者晶体结构才行
: 要是你能拿到zymogen的结构呢，这个是比较好回答了
: 但你也说了这个酶不稳定，你想拿到zymogen的结构不做几个点突变把它稳定住
| g*****p
发帖数: 451 | 24 哦，这样的话就很合情合理了
你开始的CHO分泌型表达，蛋白在培养基里面的浓度是很低的
一般表达良好的外源蛋白在CHO中最多也就1~10 mg/L，如果你的蛋白分子量在一般范围
20~50 kD, 那蛋白酶浓度也就0.02uM或者多点，况且pH比较高，酶的活性也低，所以你
能看到很多full length的酶，E.coli表达的东西都是包涵体，活性全无，自然也就大
都是
full length了
合成多肽切割实验不是证明有其他蛋白酶能切，而是证明它自己能识别这个位点，而且
可以
把动力学参数算出来，不过这个是反式剪切实验，至于你的自切是反式切割还是顺式切割
就没办法证明了
你说的pH induced 酶自切活性是个很有趣的发现
我觉得你得查查文献把这个酶的细胞定位搞清楚
因为在endosome pH5-6,如果酶定位在这里，那跟其生理功能是非常相关的
至少我知道的一个例子是流感病毒HA，它发挥膜融合功能的时候就是可以在endosome通过
pH induced构象变化，然后进行病毒－细胞膜融合
如果你的pH导致构象变化是有意义的
那做药就至少有3种途径了
1.catalytic site
2.autocleavage site
3.找个compound把构象变化的地方block住，不准它进行构象变化
还是蛮有意思的
,
【在 l******g 的大作中提到】
: 谢谢你的回复.
: 4度下过夜就truncated的蛋白是从CHO细胞里面表达出来的,分泌到细胞外面,纯化后大
: 部分是truncated,小部分是intact的. 放过夜intact的就没有了. 这个cell line如果
: 培养超过3天,基本上培养基里面intact的就非常少了(我估计是因为pH下降, 酶活性提
: 高的缘故). 后来才用E.coli来表达,形成包含体还是比较稳定的,只有作western才能看
: 到truncated. 在高pH下复性, 拿到的都是intact的.
: 如果合成一段多肽包含cleavage site, 和我的蛋白混一起,如果多肽能被降解,是不是
: 说明有其他protease存在? 我在药厂, 本来是要把这蛋白作个therapeutical 药物的,
: 现在希望不大, 上头不太可能同意花时间作结晶什么的.
| w*******2
发帖数: 6 | 25 我有过一个类似的经历，重组表达cathepsin L-like cysteine protease会发生intact
变为truncated。 | l**********1
发帖数: 5204 | |
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