r******y
发帖数: 21907 | 1 我现在需要把promoter和gene CDS克隆到一起。我先是分别克隆promoter and gene
CDS，然后pcr clean-up后把两者混合起来再分别用promoter的forward primer + gene
reverse primer做pcr，可是TA cloning后总不对，跑胶后看到合适大小的带也很弱，
我的pcr混合产物作了1:10 dilution。gene CDS is around 3.5 kb, promoter is 1.5
kb.是不是太长了？请指教！如果用gDNA序列太大了，以后也不好做。。。-- |
C*******e
发帖数: 4348 | 2 你这第二步的PCR产物大小对么？
如果promoter和gene之间你没有留overlapping region的话
不太能理解为什么这二步PCR应该work
“然后pcr clean-up后把两者混合起来再分别用promoter的forward primer + gene
reverse primer做pcr” |
r******y
发帖数: 21907 | 3 第二步不止一条条带，大小对的条带比较弱 还有你说的overlapping region是指的
primers，promoter reverse and gene forward prime有overlapping吗？是的话 大约
有10 bp overlapping oligos还是说这个overlapping region有其他的oligo代替？
thanks!【 在 Chamgrape (香槟葡萄) 的大作中提到: 】 |
C*******e
发帖数: 4348 | 4 promoter reverse和gene forward吧
10bp overlap是不是有点太短了
相对于你两个片段来说（一个1.5kb一个3kb)
这个第二步PCR应该算是mega PCR吧
一般要摸条件优化的
很多时候前5个循环是不放promoter fwd primer和gene reverse primer的
等前几个循环产生足够多的full length template以后
再放两端的primer进去
如果第二步PCR你都不能确定有你要的终产物的话
做TA cloning出不来不奇怪啊
如果你确定有终产物的话
我建议是胶回收以后再做TA cloning
不然乱七八糟东西太多了
【在 r******y 的大作中提到】
: 第二步不止一条条带，大小对的条带比较弱 还有你说的overlapping region是指的
: primers，promoter reverse and gene forward prime有overlapping吗？是的话 大约
: 有10 bp overlapping oligos还是说这个overlapping region有其他的oligo代替？
: thanks!【 在 Chamgrape (香槟葡萄) 的大作中提到: 】
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r******y
发帖数: 21907 | 5 好 谢谢 我是一开始什么都加进去了 我再试试按你说的前5不加primer先。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: promoter reverse和gene forward吧
: 10bp overlap是不是有点太短了
: 相对于你两个片段来说（一个1.5kb一个3kb)
: 这个第二步PCR应该算是mega PCR吧
: 一般要摸条件优化的
: 很多时候前5个循环是不放promoter fwd primer和gene reverse primer的
: 等前几个循环产生足够多的full length template以后
: 再放两端的primer进去
: 如果第二步PCR你都不能确定有你要的终产物的话
: 做TA cloning出不来不奇怪啊
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C*******e
发帖数: 4348 | 6 前5不加primer倒是小问题
你这里overlap的区太短了
你想你普通PCR的primer的priming region还有18-24呢
如果你认定第二步PCR肯定有target product出来了
就多做一点然后胶纯化，做TA cloning
【在 r******y 的大作中提到】
: 好 谢谢 我是一开始什么都加进去了 我再试试按你说的前5不加primer先。。。
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r******y
发帖数: 21907 | 7 如果overlapping要18-24 那primer很长了Tm不太好匹配，我回头再看看primer吧。谢~
【在 C*******e 的大作中提到】
: 前5不加primer倒是小问题
: 你这里overlap的区太短了
: 你想你普通PCR的primer的priming region还有18-24呢
: 如果你认定第二步PCR肯定有target product出来了
: 就多做一点然后胶纯化，做TA cloning
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s********r
发帖数: 312 | 8 我做过一个PCR，一个40+bp，一个80+bp，最后还是搞出来了，但是条件是蛮苛刻的
谢~
【在 r******y 的大作中提到】
: 如果overlapping要18-24 那primer很长了Tm不太好匹配，我回头再看看primer吧。谢~
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A**********0
发帖数: 6942 | 9 try clontech "Infusion" kit :)
a little pricy, but you'll love it.
gene
.5
【在 r******y 的大作中提到】
: 我现在需要把promoter和gene CDS克隆到一起。我先是分别克隆promoter and gene
: CDS，然后pcr clean-up后把两者混合起来再分别用promoter的forward primer + gene
: reverse primer做pcr，可是TA cloning后总不对，跑胶后看到合适大小的带也很弱，
: 我的pcr混合产物作了1:10 dilution。gene CDS is around 3.5 kb, promoter is 1.5
: kb.是不是太长了？请指教！如果用gDNA序列太大了，以后也不好做。。。--
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C*******e
发帖数: 4348 | 10 overlapping一般不止18-24
每个实验室习惯不一样
不过一般也不是你这种用法
这种mega PCR一般是用来做点突变的
谢~
【在 r******y 的大作中提到】
: 如果overlapping要18-24 那primer很长了Tm不太好匹配，我回头再看看primer吧。谢~
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C*******e
发帖数: 4348 | 11 两个primer 七十几bp，甚至一百bp左右的我都做过好几个
主要是两个primer要差不多
PCR本身条件没有那么难摸
【在 s********r 的大作中提到】
: 我做过一个PCR，一个40+bp，一个80+bp，最后还是搞出来了，但是条件是蛮苛刻的
:
: 谢~
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r******y
发帖数: 21907 | 12 啥苛刻条件？@@
【在 s********r 的大作中提到】
: 我做过一个PCR，一个40+bp，一个80+bp，最后还是搞出来了，但是条件是蛮苛刻的
:
: 谢~
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r******y
发帖数: 21907 | 13 这个你用的片断也大吧 很多是那种整个gDNA的连接，我这个还算短片断 40应该够了吧？
【在 C*******e 的大作中提到】
: 两个primer 七十几bp，甚至一百bp左右的我都做过好几个
: 主要是两个primer要差不多
: PCR本身条件没有那么难摸
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