b***a 发帖数: 147 | 1 从一个细胞株里提的蛋白,IgG做阴性对照,分别测蛋白A和蛋白B,用蛋白C做阳性对照。
结果是,input的lane里面都是干干净净,一点都没有,IgG的lane,可以见到重链,但
是向下的拖影很严重,蛋白A/B/C也是这样,拖影很严重,目的条带似有似无,第一次
做这几个蛋白,据说蛋白C是阳性对照,应该不错 的。
对了,A和B是核蛋白,我提的是总蛋白,就是提取的时候,用裂解液时间长一些,
vortex剧烈些。
觉得奇怪的是,为什么input里面干干净净,IP以后 反而有东西?这不是无中生有么?
我觉得从结果看,Western blot的过程应该没问题的,感觉是IP的问题,拖影可能是洗
脱的不够吧,可是这无中生有就没法解释了,要是一个抗体还可能是什么步骤错了,可
是三个抗体都这样,就奇怪了。。
盼高手指点一二。。。。 |
I*****y 发帖数: 6402 | 2 这有什么奇怪的?你的IP sample load了多少?是input量的多少倍?input最多也就lo
ad 几十微克的蛋白量吧?
蛋白C做阳性对照,是和A还是B结合?
照。
【在 b***a 的大作中提到】 : 从一个细胞株里提的蛋白,IgG做阴性对照,分别测蛋白A和蛋白B,用蛋白C做阳性对照。 : 结果是,input的lane里面都是干干净净,一点都没有,IgG的lane,可以见到重链,但 : 是向下的拖影很严重,蛋白A/B/C也是这样,拖影很严重,目的条带似有似无,第一次 : 做这几个蛋白,据说蛋白C是阳性对照,应该不错 的。 : 对了,A和B是核蛋白,我提的是总蛋白,就是提取的时候,用裂解液时间长一些, : vortex剧烈些。 : 觉得奇怪的是,为什么input里面干干净净,IP以后 反而有东西?这不是无中生有么? : 我觉得从结果看,Western blot的过程应该没问题的,感觉是IP的问题,拖影可能是洗 : 脱的不够吧,可是这无中生有就没法解释了,要是一个抗体还可能是什么步骤错了,可 : 是三个抗体都这样,就奇怪了。。
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z********8 发帖数: 818 | |
b***a 发帖数: 147 | 4 肯定是IP用的蛋白量多啊,差不多有1mg的总蛋白吧,你的意思是不是说IP起了一个
purify and concentrate的作用? 你是说,因为input的量太少,所以测不出?
我是分别用A/B/C的抗体把它们pull down下来, 然后做下面的ChIP实验,现在只是试
试抗体行不行,结果出现这个问题,
蛋白C的抗体,据老板说是很不错的,所以作为阳性对照,判断实验过程没问题。
lo
【在 I*****y 的大作中提到】 : 这有什么奇怪的?你的IP sample load了多少?是input量的多少倍?input最多也就lo : ad 几十微克的蛋白量吧? : 蛋白C做阳性对照,是和A还是B结合? : : 照。
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s*********t 发帖数: 600 | 5 粘在beads上的 假阳性
pre clear下试试
【在 b***a 的大作中提到】 : 肯定是IP用的蛋白量多啊,差不多有1mg的总蛋白吧,你的意思是不是说IP起了一个 : purify and concentrate的作用? 你是说,因为input的量太少,所以测不出? : 我是分别用A/B/C的抗体把它们pull down下来, 然后做下面的ChIP实验,现在只是试 : 试抗体行不行,结果出现这个问题, : 蛋白C的抗体,据老板说是很不错的,所以作为阳性对照,判断实验过程没问题。 : : lo
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b***a 发帖数: 147 | 6 pre clear? 什么意思?
怎么做啊?没听过啊 |
f*c 发帖数: 2726 | 7 1, load多一点,或WB 用多一点抗体,至少input得看到才行啊,才能确定是哪个条带。
2,可以用light chain specific secondary antibody,降低IP background,也可以Preclear,就是ip加抗体前,先用igG 去掉一些background.
【在 b***a 的大作中提到】 : 肯定是IP用的蛋白量多啊,差不多有1mg的总蛋白吧,你的意思是不是说IP起了一个 : purify and concentrate的作用? 你是说,因为input的量太少,所以测不出? : 我是分别用A/B/C的抗体把它们pull down下来, 然后做下面的ChIP实验,现在只是试 : 试抗体行不行,结果出现这个问题, : 蛋白C的抗体,据老板说是很不错的,所以作为阳性对照,判断实验过程没问题。 : : lo
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b***a 发帖数: 147 | |