b**********8
发帖数: 349 | 1 如题，lab里面之前一直用的磷酸钙沉淀法，个人觉得特别繁琐。我比较懒，想换用
lipo2000或者genejuice来转，我们一直用的是PLKO.1shRNA+PLP1+PLP2+PLP/VSVG系统
，在10cm dish里面操作。有谁使用这套系统制备慢病毒，并且刚好也用lipo2000或者
genejuice转染试剂的，甩一个你们的成熟的protocol给我吧，特别是各质粒的用量，
换液时间，收集上清的时间等参数，越详细越好啦。不想为了摸索条件再浪费1个礼拜
的时间了。
谢谢 |
b**********8
发帖数: 349 | |
b*****o
发帖数: 150 | |
b**********8
发帖数: 349 | 4 非常感谢。这个链接给出的protocol很详细。但是我又有一个新的问题，在还掉含有转
染复合物的medium之后，新加入的medium中添加了抗生素，这个会对之后感染病毒的细
胞有影响吗？会不会产生很大的毒性？因为慢病毒本身的细胞毒性其实也挺明显的，如
果再加上抗生素的压力的话，感染的细胞岂不是要死光光？
【在 b*****o 的大作中提到】
: This maybe helpful for you.
: http://www.addgene.org/tools/protocols/pLKO/#E
|
a*******a
发帖数: 4233 | 5 google tronolab
用lipo也可以做，而且很方便，质粒不变转染方法换一下就行了
其他收病毒条件什么的影响都不大。 病毒大致是在24-72小时之间出来。
问题在于如果需要浓缩的话，一次转几十皿用lipo成本太高。
常规抗生素没影响的。 |
b**********8
发帖数: 349 | 6 多谢回复，其实之前我们用的protocol就是根据tronolab的来的，在我的这个帖子里有
我们之前的方法介绍，http://www.mitbbs.com/article_t0/Biology/31599323.html
根据我最近几次摸索的经验，用磷酸钙转染有个缺陷就是换液之后必须用PBS洗两遍，不洗的
话后面收集的virus里有很多磷酸钙沉淀，感染细胞后medium里面很多黑色的小点点，
这玩意对感染效率影响蛮大的。但是PBS洗的话，293FT细胞很容易就飘起来了。我现在
就想省事点，换个转染试剂转染，换液后直接加新的medium。请问你有用lipo做过吗？
我现在就是没有经验用lipo的话，DNA量该用多少。以10cm dish为例，之前我们四个质
粒加起来一共有40ug，如果用lipo等转染试剂的话，我想应该用不到这么多DNA吧。
【在 a*******a 的大作中提到】
: google tronolab
: 用lipo也可以做，而且很方便，质粒不变转染方法换一下就行了
: 其他收病毒条件什么的影响都不大。 病毒大致是在24-72小时之间出来。
: 问题在于如果需要浓缩的话，一次转几十皿用lipo成本太高。
: 常规抗生素没影响的。
|
j****x
发帖数: 1704 | 7 不差钱的话就用Fugene HD，稳定性和细胞毒性都优于普通磷酸钙转。我一般都在
150cm2的flask里面转，效率很高
https://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/BIOCHEMI/no3_08/pdfs/17.pdf
，不洗的
【在 b**********8 的大作中提到】
: 多谢回复，其实之前我们用的protocol就是根据tronolab的来的，在我的这个帖子里有
: 我们之前的方法介绍，http://www.mitbbs.com/article_t0/Biology/31599323.html
: 根据我最近几次摸索的经验，用磷酸钙转染有个缺陷就是换液之后必须用PBS洗两遍，不洗的
: 话后面收集的virus里有很多磷酸钙沉淀，感染细胞后medium里面很多黑色的小点点，
: 这玩意对感染效率影响蛮大的。但是PBS洗的话，293FT细胞很容易就飘起来了。我现在
: 就想省事点，换个转染试剂转染，换液后直接加新的medium。请问你有用lipo做过吗？
: 我现在就是没有经验用lipo的话，DNA量该用多少。以10cm dish为例，之前我们四个质
: 粒加起来一共有40ug，如果用lipo等转染试剂的话，我想应该用不到这么多DNA吧。
|
s******s
发帖数: 13035 | 8 我们在60mm dish里面做的
4ml medium + 1ml lipo的mix
里面大概20ul lipo, 2ug pMDL， 1ug VSVG, 1.5ug Rev, your DNA 3ug.
，不洗的
【在 b**********8 的大作中提到】
: 多谢回复，其实之前我们用的protocol就是根据tronolab的来的，在我的这个帖子里有
: 我们之前的方法介绍，http://www.mitbbs.com/article_t0/Biology/31599323.html
: 根据我最近几次摸索的经验，用磷酸钙转染有个缺陷就是换液之后必须用PBS洗两遍，不洗的
: 话后面收集的virus里有很多磷酸钙沉淀，感染细胞后medium里面很多黑色的小点点，
: 这玩意对感染效率影响蛮大的。但是PBS洗的话，293FT细胞很容易就飘起来了。我现在
: 就想省事点，换个转染试剂转染，换液后直接加新的medium。请问你有用lipo做过吗？
: 我现在就是没有经验用lipo的话，DNA量该用多少。以10cm dish为例，之前我们四个质
: 粒加起来一共有40ug，如果用lipo等转染试剂的话，我想应该用不到这么多DNA吧。
|
a*******a
发帖数: 4233 | 9 不需要洗， 收病毒上清以后pall 0.45um滤器过滤一下。
我一般用fugene hd， 更省事
10cm dish 20ug质粒，50ul fugene。
我是用plko+r8.91+vsvg的。
ps 我个人觉得钙转最省事
5min转完， 10-24小时之内看心情换液就可以了。。。。
脂质体的话还要等半个小时穿插传其他细胞，麻烦。。
，不洗的
【在 b**********8 的大作中提到】
: 多谢回复，其实之前我们用的protocol就是根据tronolab的来的，在我的这个帖子里有
: 我们之前的方法介绍，http://www.mitbbs.com/article_t0/Biology/31599323.html
: 根据我最近几次摸索的经验，用磷酸钙转染有个缺陷就是换液之后必须用PBS洗两遍，不洗的
: 话后面收集的virus里有很多磷酸钙沉淀，感染细胞后medium里面很多黑色的小点点，
: 这玩意对感染效率影响蛮大的。但是PBS洗的话，293FT细胞很容易就飘起来了。我现在
: 就想省事点，换个转染试剂转染，换液后直接加新的medium。请问你有用lipo做过吗？
: 我现在就是没有经验用lipo的话，DNA量该用多少。以10cm dish为例，之前我们四个质
: 粒加起来一共有40ug，如果用lipo等转染试剂的话，我想应该用不到这么多DNA吧。
|
