h*****u
发帖数: 201 | 1 如果要把一段外来的基因（比如一个plasmid或者染色体里面的一段已知基因）复制出
来，插入到另一个plasmid或者染色体的特定位置去，是怎么操作的？定位的原理是什
么？
我找了些资料，似乎传统的方法是根据特殊的restriction enzymes和DNA ligases来定
位。又发现最近的一些文献里用lambda red system来进行基因改造。两种方法的原理
我都没看明白，请版上的朋友不吝赐教。。。谢谢！ |
I***a
发帖数: 13467 | 2 可以让基因A两端带有特定位子的相同序列，
然后通过同源重组插入到这个位子。 |
h*****u
发帖数: 201 | 3 谢谢！能否详细说说这个过程是怎么实现的？比如说要把一个plasmid里的一段A基因序
列插入到细菌染色体里的序列B-C的中间，是不是得先把A、B、C克隆出来，在A两边连
上B和C（怎么连接？），然后把B-A-C片段引入细菌，然后细菌能自己把B-A-C片段整合
到自己的染色体中，并且是取代原来的B-C序列？这些问题可能很傻，所以我会有大包
子酬谢 ：）
【在 I***a 的大作中提到】
: 可以让基因A两端带有特定位子的相同序列，
: 然后通过同源重组插入到这个位子。
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I***a
发帖数: 13467 | 4 你说的差不多是的，
怎么连接？可以加酶切位点，然后一步一连起来，也可以通过PCR连起来，
还要有个筛选标记，帮你筛选出你要的 |
h**********r
发帖数: 671 | 5 差不多是这样的，还要看你要做啥细菌。
有的细菌抗拒这种同源重组
google一下suicide plasmid之类的
可以做knock out,knock in
还能利用marker负选择把抗性基因给去掉 |
A********2
发帖数: 107 | 6 i) clone your target gene into a plasmid upstream of an antibiotic
resistance gene (e.x. Kanamycin) ii) amplify the two-gene cassette using
primers with 40nt homologous sequences iii) transform the linear fragments
into a recipient strain (e.x. E. coli) with an inducible Lamda Red System iv
) flip out the cassette with or without leaving a scar sequence, depending
on if there is FRT seq or I-sceI site in the cassette |
C*******e
发帖数: 4348 | 7 lambda red system的有一个2002年的PNAS
那个实验室有这个E.coli菌株
插入片段两端有46nts的flanking region就可以了
线性DNA片段和目标plasmid一起电转化到那个E.coli菌株就行
就是你要有个方法筛
比如线性DNA片段上有另外一个抗性之类的
不然大海捞针
【在 h*****u 的大作中提到】
: 如果要把一段外来的基因（比如一个plasmid或者染色体里面的一段已知基因）复制出
: 来，插入到另一个plasmid或者染色体的特定位置去，是怎么操作的？定位的原理是什
: 么？
: 我找了些资料，似乎传统的方法是根据特殊的restriction enzymes和DNA ligases来定
: 位。又发现最近的一些文献里用lambda red system来进行基因改造。两种方法的原理
: 我都没看明白，请版上的朋友不吝赐教。。。谢谢！
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