W****7
发帖数: 426 | 1 请教下哈~
有没有什么好的方法标记短肽（20-30aa）的？要求荧光分子比较小的，主要是想看这
个短肽到底能不能进到细胞内，还是只是结合在细胞膜上。或者不用荧光别的方法能检
测也行。。。。
谢谢！ |
y******8
发帖数: 1764 | 2 Live fluorescent imaging of short peptide with subcellular resolution. This
would be the method of the year if you can make it routinely working.
Radioactive labeling might be the cheapest universal method to try. Other
alternatives are very expensive.
【在 W****7 的大作中提到】
: 请教下哈~
: 有没有什么好的方法标记短肽（20-30aa）的？要求荧光分子比较小的，主要是想看这
: 个短肽到底能不能进到细胞内，还是只是结合在细胞膜上。或者不用荧光别的方法能检
: 测也行。。。。
: 谢谢！
|
e****s
发帖数: 1125 | 3 试试看Cys或者Lys的特异标记基团
【在 W****7 的大作中提到】
: 请教下哈~
: 有没有什么好的方法标记短肽（20-30aa）的？要求荧光分子比较小的，主要是想看这
: 个短肽到底能不能进到细胞内，还是只是结合在细胞膜上。或者不用荧光别的方法能检
: 测也行。。。。
: 谢谢！
|
b******y
发帖数: 627 | 4 Labeling a short peptide is not hard at all, especially so if you are
ordering the peptide from a company. They can do a variety of fluorophore
labeling.
If you are going to DIY, as suggested by LS, try Cys or Lys or N-terminus
labeling. For example, if there is single Cys or affordable to add one, you
can buy different Maleimide-fluorophore and do the conjugation yourself. If
there is not Cys available, you can buy NHS labeled fluorophore and do the
conjugtion with the N-terminus and/or Lys.
Personally, I like to order the peptide labeled with fluorophore from a
company or a core facility on campus if you have the option. It is so much
easier. In addition, you have to have the peptide in the first place.
Obtaining such a short peptide recombinantly is not easy without some sort
of clever design. |
W****7
发帖数: 426 | 5 感谢楼上3位的回复！
我们的肽段是直接在公司合成的，所以比较容易。如果公司可以直接加标记的话我们也
会直接在公司合成的，不会浪费时间在这些小事上。
但是现在的问题就是标记分子的分子量大小，我不不希望分子量太大，否则有可能影响
肽段进入细胞（如果它真的能进细胞的话）。
to ym: 我们应该没有那么高resolution的荧光显微镜，同位素标记的话，不知道怎么
检测它到底能不能进如细胞内。
to 芝麻和小熊：Cys or Lys 也许是好主意，我们的肽段确实有一个Cys，但是具体原
理和操作我需要在查些资料来看看。如果两位有什么推荐的材料的话就更好了！谢谢回
复！ |
b******y
发帖数: 627 | 6 Labeling via Cys and Lys suffer the same problem as ordering from company
because the fluorophores available will be the same as those provided by
peptide synthesis company.
One idea though, can you 1) biotinylate your peptide, 2) deliver to the cell
, and 3) fix and then IF based on SA? |
y******8
发帖数: 1764 | 7 Label after fix is easier for you. e.g. antibody.
However, if the resolution is not high enough, I doubt that you will get any
better result than ultra-centrifugation fractionation.
【在 W****7 的大作中提到】
: 感谢楼上3位的回复！
: 我们的肽段是直接在公司合成的，所以比较容易。如果公司可以直接加标记的话我们也
: 会直接在公司合成的，不会浪费时间在这些小事上。
: 但是现在的问题就是标记分子的分子量大小，我不不希望分子量太大，否则有可能影响
: 肽段进入细胞（如果它真的能进细胞的话）。
: to ym: 我们应该没有那么高resolution的荧光显微镜，同位素标记的话，不知道怎么
: 检测它到底能不能进如细胞内。
: to 芝麻和小熊：Cys or Lys 也许是好主意，我们的肽段确实有一个Cys，但是具体原
: 理和操作我需要在查些资料来看看。如果两位有什么推荐的材料的话就更好了！谢谢回
: 复！
|
W****7
发帖数: 426 | 8 没有很好的antibody可用。
即使有的话fractionation或者超速梯度离心也不容易区分內源的还是uptake是吧？即
使用无內源表达的细胞系的话WB的灵敏度可能也不如荧光来的高些吧。所以可能还是倾
向于找一种合适的标记物。 |
b******y
发帖数: 627 | 9 Biotin-SA-Fluorophore is a good choice, in case you missed my previous
suggestion: i.e. biotinylated your peptide and used fluorophore labeled
Straptavdin to detect, both of which should be easy to get. |
W****7
发帖数: 426 | 10 I think this is a good one.
Thank you for your input! |
y******8
发帖数: 1764 | 11 Radioactive labeled peptide is the easiest, then.
Endogenous biotin is also problematic. On the other hand, biotin may not be
small enough for your peptide.
【在 W****7 的大作中提到】
: 没有很好的antibody可用。
: 即使有的话fractionation或者超速梯度离心也不容易区分內源的还是uptake是吧？即
: 使用无內源表达的细胞系的话WB的灵敏度可能也不如荧光来的高些吧。所以可能还是倾
: 向于找一种合适的标记物。
|
W****7
发帖数: 426 | 12 你说的也有道理，我在看看其他的荧光标记吧。
说一千道一万，实验这东西最后还得一个个试，幸运的1,2次就成功了，不幸的时候。
。。。。
不说了，MD谁让我们进这行了，都是眼泪。
总之谢谢所有人的建议，还是很有帮助的，比自己一个人闷头想强多了。 |
y******8
发帖数: 1764 | 13 一个一个试，是最费神的。所以很多人就干脆地上S35，或者H3了。
【在 W****7 的大作中提到】
: 你说的也有道理，我在看看其他的荧光标记吧。
: 说一千道一万，实验这东西最后还得一个个试，幸运的1,2次就成功了，不幸的时候。
: 。。。。
: 不说了，MD谁让我们进这行了，都是眼泪。
: 总之谢谢所有人的建议，还是很有帮助的，比自己一个人闷头想强多了。
|
