r*****5
发帖数: 1876 | 1 以前没有做过这方面的，特像大家请教，谢过了 ：）
跟别人要了个他自己建的载体， 没有全部序列，只有酶切位点那部分的序列， 我也不
知道转录起始点在哪？ 我想做的是： 把我的蛋白CDNA 序列从起始密码到终止密码拷
贝过来， 再在CDNA 序列前加上KOZAC 序列， 最后在两端加上酶切位点和保护性碱基
就好了？ 这样对么？
可是怎么样才能保证没有移码呢？ 请各位指教啊？
我要用此质粒做转基因老鼠，已经费掉１万块了，如果再不成功，就惨了， 谢谢各位
。 |
a****d
发帖数: 1919 | 2 不清楚具体质粒结构，不过如果只是过表达一个蛋白，没有另外fusion其他tag或者GFP
fragment的话，你这样操作就够了，不需要担心移码问题。如果你另外fusion GFP或
者其他tag，则需要考虑表达的cDNA和连接的tag in frame。 |
s******y
发帖数: 28562 | 3 把质粒从头到尾测个续不就完了么？你既然知道部分序列，用它来设计引物
就好了，或者用你克隆进去的序列来设计引物。然后一段接一段的设计引物，
直接把全序列测完为止
还有，你可以把质粒先用来短暂转染细胞来表达蛋白么？如果可以的话那就更
简单了，表达之后用western blot 测一下，如果能够和抗体特异反应就说明
氨基酸序列是对的，再看看大小对不对，就好了。
【在 r*****5 的大作中提到】
: 以前没有做过这方面的，特像大家请教，谢过了 ：）
: 跟别人要了个他自己建的载体， 没有全部序列，只有酶切位点那部分的序列， 我也不
: 知道转录起始点在哪？ 我想做的是： 把我的蛋白CDNA 序列从起始密码到终止密码拷
: 贝过来， 再在CDNA 序列前加上KOZAC 序列， 最后在两端加上酶切位点和保护性碱基
: 就好了？ 这样对么？
: 可是怎么样才能保证没有移码呢？ 请各位指教啊？
: 我要用此质粒做转基因老鼠，已经费掉１万块了，如果再不成功，就惨了， 谢谢各位
: 。
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r*****5
发帖数: 1876 | 4 谢谢你的指教，
我没有融合其他蛋白，就是一个蛋白，那像KOZAK 序列多一个少一个碱基什么的，也没
有什么大问题，对么？
我老板也不懂，我上次建好质粒去做老鼠了，结果一个阳性老鼠也没有，我老板就一直
在问我有没有保证移码没有发生，我就心虚了啊，哈 |
r*****5
发帖数: 1876 | 5 谢谢你的指教，
我没有融合其他蛋白，就是一个蛋白，那像KOZAK 序列多一个少一个碱基什么的，也没
有什么大问题，对么？
我老板也不懂，我上次建好质粒去做老鼠了，结果一个阳性老鼠也没有，我老板就一直
在问我有没有保证移码没有发生，我就心虚了啊，哈 |
r*****5
发帖数: 1876 | 6 sunnyday,谢谢你，
问题就在于我们这个载体只在活体肺里才高表达，我用好多细胞做过暂转染细胞来表达
，都没有成功，烦啊。
质粒建好后，也测序了，我插入的序列也对，可是不知道为什么没有阳性老鼠
【在 s******y 的大作中提到】
: 把质粒从头到尾测个续不就完了么？你既然知道部分序列，用它来设计引物
: 就好了，或者用你克隆进去的序列来设计引物。然后一段接一段的设计引物，
: 直接把全序列测完为止
: 还有，你可以把质粒先用来短暂转染细胞来表达蛋白么？如果可以的话那就更
: 简单了，表达之后用western blot 测一下，如果能够和抗体特异反应就说明
: 氨基酸序列是对的，再看看大小对不对，就好了。
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a****d
发帖数: 1919 | 7 从ATG开始序列一致的话，不会有移码发生。KOZAK序列改变不会导致移码的。另外应该
像SUNY讲得那样，先做个简单的transfection，看看蛋白表达是否正常。然后再去做老
鼠。
【在 r*****5 的大作中提到】
: 谢谢你的指教，
: 我没有融合其他蛋白，就是一个蛋白，那像KOZAK 序列多一个少一个碱基什么的，也没
: 有什么大问题，对么？
: 我老板也不懂，我上次建好质粒去做老鼠了，结果一个阳性老鼠也没有，我老板就一直
: 在问我有没有保证移码没有发生，我就心虚了啊，哈
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s******y
发帖数: 28562 | 8 我觉得你最好把限制酶之前的序列也测一下（自己设计一个引物，倒过来往上游
测）
一般而言，要保证不移码的话，最好是这样：
1。放kozak sequence,
2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon.
【在 r*****5 的大作中提到】
: sunnyday,谢谢你，
: 问题就在于我们这个载体只在活体肺里才高表达，我用好多细胞做过暂转染细胞来表达
: ，都没有成功，烦啊。
: 质粒建好后，也测序了，我插入的序列也对，可是不知道为什么没有阳性老鼠
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r*****5
发帖数: 1876 | 9 请问kozak sequence不是应该放在要表达的蛋白的ATG 之前么？就是的放在要表达的蛋
白的ATG的左面，对么
2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon.
那这个stop codon是做什么的啊，
问题是我测载体的序列，测完了该怎么分析呢？ 我也不知道标准序列，很是郁闷
【在 s******y 的大作中提到】
: 我觉得你最好把限制酶之前的序列也测一下（自己设计一个引物，倒过来往上游
: 测）
: 一般而言，要保证不移码的话，最好是这样：
: 1。放kozak sequence,
: 2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon.
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s******y
发帖数: 28562 | 10 Kozak sequence 的确就是和你的蛋白的ATG 融合在一起的。
Kozak sequence 之前的stop codon 可以保证前面的序列如果不小心导致了蛋白
翻译到了那里肯定会被切断而不会干扰你后面的序列
【在 r*****5 的大作中提到】
: 请问kozak sequence不是应该放在要表达的蛋白的ATG 之前么？就是的放在要表达的蛋
: 白的ATG的左面，对么
: 2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon.
: 那这个stop codon是做什么的啊，
: 问题是我测载体的序列，测完了该怎么分析呢？ 我也不知道标准序列，很是郁闷
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r*****5
发帖数: 1876 | 11 好的，非常感谢您的指教， 看看我这次能不能成功 ：） |
w******n
发帖数: 767 | 12 没有转基因阳性小鼠，还是检不到蛋白表达？
【在 r*****5 的大作中提到】
: sunnyday,谢谢你，
: 问题就在于我们这个载体只在活体肺里才高表达，我用好多细胞做过暂转染细胞来表达
: ，都没有成功，烦啊。
: 质粒建好后，也测序了，我插入的序列也对，可是不知道为什么没有阳性老鼠
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r*****5
发帖数: 1876 | 13 没有阳性小老鼠，GENE－TYPING 没有发现阳性的 ：（
【在 w******n 的大作中提到】
: 没有转基因阳性小鼠，还是检不到蛋白表达？
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s******y
发帖数: 28562 | 14 如果genotype 都没有通过的话，那就和移码不移码没有关系，而是你们的基因
根本就没有成功插入
【在 r*****5 的大作中提到】
: 没有阳性小老鼠，GENE－TYPING 没有发现阳性的 ：（
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r*****5
发帖数: 1876 | 15 谢谢指导，可是我们有很多小老鼠啊，请问什么原因可以导致阳性率这么低呢？ 做转
基因的人也很有经验的啊， |
