t*****z
发帖数: 1598 | 1 本人正在用一组带有很多含糊的位点的引物做PCR，
比方说：CGRTCAKGATCGWCSATAGC
我也不知道怎么称呼，是“degenerate primer”吗？
我想，在PCR反应体系中，其实只有一小部分引物真正与我的模板相结合，
比如我的引物是：CGRTCAKGATCGWCSATAGC
我的模板序列是：CGATCAGGATCGACGATAGC
里面有四个位点是简并的，所以在引物溶液当中真正与模板完全匹配的引物分子不过是
总分子个数的16分之一。
虽说别的不完全匹配的引物分子也或多或少能够结合，但是总体说来，简并引物的结合
效率要低于正常引物吧。
所以我想，要用简并引物做好PCR，是否需要加多于正常量的引物，以保证溶液中匹配
的分子个数达到正常水平呢？
我在摸索PCR条件。本来引物浓度通常不会当做需要优化的条件之一的，但是现在我打
这方面主意了。
以上是我的猜测，不知真实情况怎么样？请有经验的前辈们指点！多谢大家，新年实验
顺利！ |
z*****g
发帖数: 306 | 2 Why not just run once? You will have your answer. |
w****3
发帖数: 14 | 3 I used to use 10 times amount of primer (100 pmol) than regular PCR reaction
(10 pmol) and also ran at lower annealing temperature. |
s********n
发帖数: 2939 | 4 像你这种情况正确引物的浓度不算低，annealing temperature是关键！
【在 t*****z 的大作中提到】
: 本人正在用一组带有很多含糊的位点的引物做PCR，
: 比方说：CGRTCAKGATCGWCSATAGC
: 我也不知道怎么称呼，是“degenerate primer”吗？
: 我想，在PCR反应体系中，其实只有一小部分引物真正与我的模板相结合，
: 比如我的引物是：CGRTCAKGATCGWCSATAGC
: 我的模板序列是：CGATCAGGATCGACGATAGC
: 里面有四个位点是简并的，所以在引物溶液当中真正与模板完全匹配的引物分子不过是
: 总分子个数的16分之一。
: 虽说别的不完全匹配的引物分子也或多或少能够结合，但是总体说来，简并引物的结合
: 效率要低于正常引物吧。
|
t*****z
发帖数: 1598 | |
l*********1
发帖数: 351 | |
