h***9
发帖数: 662 | 1 一个准备用来做knock-in老鼠的targeting vector（14kb),用invitrogen的kit做了
maxi-prep,然后用NotI linearize,我确定NotI是单一酶切位点,可是为什么出来这么多
大大小小的片断（4kb,2.5kb,1.5kb,100bp)？ | m******5
发帖数: 1383 | | h***9
发帖数: 662 | 3 是什么原因呢？genomic DNA 污染？就觉得看到这么多小片断，往下做，心里不踏实。
core facility的人让我把我要的band从gel里切出来，纯化一下，再做
electroporation.
【在 m******5 的大作中提到】
: Ki质粒星切很常见
: 问题不大，可以用
| N2
发帖数: 81 | 4 太多的dna了
试试点单位0.5-1ug/per reaction
【在 h***9 的大作中提到】
: 是什么原因呢？genomic DNA 污染？就觉得看到这么多小片断，往下做，心里不踏实。
: core facility的人让我把我要的band从gel里切出来，纯化一下，再做
: electroporation.
| s******s
发帖数: 13035 | 5 体系放大点，用NotI-HF切看看？
【在 h***9 的大作中提到】
: 一个准备用来做knock-in老鼠的targeting vector（14kb),用invitrogen的kit做了
: maxi-prep,然后用NotI linearize,我确定NotI是单一酶切位点,可是为什么出来这么多
: 大大小小的片断（4kb,2.5kb,1.5kb,100bp)？
| m******5
发帖数: 1383 | 6 band切完再胶回收后electroporation效率会降低很多
【在 h***9 的大作中提到】
: 是什么原因呢？genomic DNA 污染？就觉得看到这么多小片断，往下做，心里不踏实。
: core facility的人让我把我要的band从gel里切出来，纯化一下，再做
: electroporation.
| n**8
发帖数: 221 | 7 you need uncut DNA as control | h***9
发帖数: 662 | 8 先谢谢大家的答复。
报告一下进展。我后来用Not1-HF切了，杂带还是在。未切的质粒里也有同样的杂带，
证明不是酶切的问题。试了老早以前做的另一个maxi prep的质粒，同样用Not1-HF切，
那个却很干净，没有杂带。
另外，差不多同时做的mini prep的这个出问题的maxi prep质粒，也出现同样的杂带。证明不是maxi prep kit的问题。
我现在怀疑是competent cell的问题了，因为老早以前用的是公司买的，最近用的是同事做
的。准备弄点公司买来的cell,重做maxi prep.
【在 h***9 的大作中提到】
: 一个准备用来做knock-in老鼠的targeting vector（14kb),用invitrogen的kit做了
: maxi-prep,然后用NotI linearize,我确定NotI是单一酶切位点,可是为什么出来这么多
: 大大小小的片断（4kb,2.5kb,1.5kb,100bp)？
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