r*****5
发帖数: 1876 | 1 哪位大狭做过啊，能不能指教下啊， 引物的设计有什么特别要求么？
主要是不会算到底是单拷贝还是双拷贝，
谢谢指教啊！！ |
w******n
发帖数: 767 | 2 误差很大，为什么不检基因组，跨删除区pcr,根据条带大小，很容易区分-/-,-/+
【在 r*****5 的大作中提到】
: 哪位大狭做过啊，能不能指教下啊， 引物的设计有什么特别要求么？
: 主要是不会算到底是单拷贝还是双拷贝，
: 谢谢指教啊！！
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r*****5
发帖数: 1876 | 3 谢谢指导， 我就是准备跨基因组， 问题是不确定要３PRIMER 一起用，还是两个两个
用啊？
谢谢 ：） |
r*****5
发帖数: 1876 | 4 你的意思是说，跨基因组的话，就可以提取基因组DNA， 然后用普通PCR就可以，对么？
这样可以确定 有没有KNOCKOUT， 但是不能确定是不是+／＿， 我的理解对么？ |
D*a
发帖数: 6830 | 5 为啥要RT PCR？
啥叫跨基因组？
你的mouse breeding 是咋设定的？是tissue specific KO？ 还是传统KO或者hetero
交配 wt？ |
w******n
发帖数: 767 | 6 电泳后，+/+是一条较大的带，+/-是一大一小，-/-是一条较小的带。
么？
【在 r*****5 的大作中提到】
: 你的意思是说，跨基因组的话，就可以提取基因组DNA， 然后用普通PCR就可以，对么？
: 这样可以确定 有没有KNOCKOUT， 但是不能确定是不是+／＿， 我的理解对么？
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D*a
发帖数: 6830 | 7 或者也可以设计三个引物，triplex PCR
这样的好处是带的大小可以比较一致，不会出现类似WT大带1000，KO小带200bp 的情况。
【在 w******n 的大作中提到】
: 电泳后，+/+是一条较大的带，+/-是一大一小，-/-是一条较小的带。
:
: 么？
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r*****5
发帖数: 1876 | 8 非常感谢啊， 那就是说要３个PRIMER 一起加， 而不是像普通PCR 那样只用２个
PRIMER，用来做PCR， 对么？
【在 w******n 的大作中提到】
: 电泳后，+/+是一条较大的带，+/-是一大一小，-/-是一条较小的带。
:
: 么？
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r*****5
发帖数: 1876 | 9 我和人家要的老鼠， 传统的KNOCKOUT ，不是组织特意的
【在 D*a 的大作中提到】
: 为啥要RT PCR？
: 啥叫跨基因组？
: 你的mouse breeding 是咋设定的？是tissue specific KO？ 还是传统KO或者hetero
: 交配 wt？
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r*****5
发帖数: 1876 | 10 能具体说说什么 是triplex PCR， 我都没有听说过，哈，谢拉
况。
【在 D*a 的大作中提到】
: 或者也可以设计三个引物，triplex PCR
: 这样的好处是带的大小可以比较一致，不会出现类似WT大带1000，KO小带200bp 的情况。
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l**********1
发帖数: 5204 | 11 Exactly,
Please go to
//www.biotechniques.com/multimedia/archive/00010/01315rr05_10077a.pdf
it shown that complete genotyping of a floxed locus is possible with three appropriately placed primers
and that this triplex PCR can be performed simulta- neously with a universal PCR assay for the detection of
Cre transgenes.
[回复]
[ 8 ]
发信人: robin95 (robin95), 信区: Biology
标 题: Re: 请教用REAL－TIME PCR 测定基因KNOCKOUT 小鼠是－／－ 还
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Feb 16 11:31:37 2012, 美东)
>非常感谢啊， 那就是说要３个PRIMER 一起加， 而不是像普通PCR 那样只用２个
>PRIMER，用来做PCR， 对么？
【在 w******n 的大作中提到】
: 电泳后，+/+是一条较大的带，+/-是一大一小，-/-是一条较小的带。
:
: 么？
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D*a
发帖数: 6830 | 12 你既然不是组织特异的Ko。pcr就很好做了，因为就是KO allele 和WT allele 分别。
genomic PCR 就可以了。回家了不方便发帖， 明天去了实验室给你找个图。 |
l**********1
发帖数: 5204 | 13 that 图 where?
【在 D*a 的大作中提到】
: 你既然不是组织特异的Ko。pcr就很好做了，因为就是KO allele 和WT allele 分别。
: genomic PCR 就可以了。回家了不方便发帖， 明天去了实验室给你找个图。
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D*a
发帖数: 6830 | 14 中间那个蓝的你也可以跟红的配对，把它反过来设计。这个看你的基因组序列了。必须
要三个引物的退火温度差不多才能都放到一起用。
我们还再加几对其他的引物测其他的transgene，比如cre啥的，也都放到一个program
里面，一次PCR就都有了。
flox啥的你要是不知道自己查查吧。
【在 r*****5 的大作中提到】
: 能具体说说什么 是triplex PCR， 我都没有听说过，哈，谢拉
:
: 况。
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l**********1
发帖数: 5204 | 15 >: flox啥的你要是不知道自己查查吧。
Just go to
//en.wikipedia.org/wiki/Cre-Lox_recombination
//en.wikipedia.org/wiki/Floxed
ps:
又学了一招 Merci Dua.
program
【在 D*a 的大作中提到】
: 中间那个蓝的你也可以跟红的配对，把它反过来设计。这个看你的基因组序列了。必须
: 要三个引物的退火温度差不多才能都放到一起用。
: 我们还再加几对其他的引物测其他的transgene，比如cre啥的，也都放到一个program
: 里面，一次PCR就都有了。
: flox啥的你要是不知道自己查查吧。
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r*****5
发帖数: 1876 | 16 真的非常感谢啊, Dua ：）
讲的很清楚啊，很实用， 给我们老鼠的人的PAPER 里有３个PRIMER， 他们也说了，WT
和KO 应该是多大片段， 我一直不确定怎么两个两个来选PRIMER， 现在知道了是３
个一起用，谢啦，
还有一个问题， 给我们老鼠的人都设计了３个引物了，不知道他们为什么还有
SOUTHERN 来做， 在文章里他们只显示了SOUTHERN 结果，而没有显示PCR 结果，
SOUTHERN 有什么特别的好处么 ？
program
【在 D*a 的大作中提到】
: 中间那个蓝的你也可以跟红的配对，把它反过来设计。这个看你的基因组序列了。必须
: 要三个引物的退火温度差不多才能都放到一起用。
: 我们还再加几对其他的引物测其他的transgene，比如cre啥的，也都放到一个program
: 里面，一次PCR就都有了。
: flox啥的你要是不知道自己查查吧。
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r*****5
发帖数: 1876 | 17 这文章也很好啊， 我原来一点不懂，没有做过， 谢谢指导，继续学习 ：）
three appropriately placed primers
universal PCR assay for the detection of
【在 l**********1 的大作中提到】
: Exactly,
: Please go to
: //www.biotechniques.com/multimedia/archive/00010/01315rr05_10077a.pdf
: it shown that complete genotyping of a floxed locus is possible with three appropriately placed primers
: and that this triplex PCR can be performed simulta- neously with a universal PCR assay for the detection of
: Cre transgenes.
: [回复]
: [ 8 ]
: 发信人: robin95 (robin95), 信区: Biology
: 标 题: Re: 请教用REAL－TIME PCR 测定基因KNOCKOUT 小鼠是－／－ 还
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D*a
发帖数: 6830 | 18 southern是把关，PCR有假阳性，再具体的我也不知道了，只知道做老鼠的时候选老鼠
必须要southern。
但是老鼠做完了以后再正常breeding就没必要southern拉。
WT
【在 r*****5 的大作中提到】
: 真的非常感谢啊, Dua ：）
: 讲的很清楚啊，很实用， 给我们老鼠的人的PAPER 里有３个PRIMER， 他们也说了，WT
: 和KO 应该是多大片段， 我一直不确定怎么两个两个来选PRIMER， 现在知道了是３
: 个一起用，谢啦，
: 还有一个问题， 给我们老鼠的人都设计了３个引物了，不知道他们为什么还有
: SOUTHERN 来做， 在文章里他们只显示了SOUTHERN 结果，而没有显示PCR 结果，
: SOUTHERN 有什么特别的好处么 ？
:
: program
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r*****5
发帖数: 1876 | 19 哦，是这样啊， 那老鼠是人家做好的，我们管人家要的，所以就做PCR 来试试，到时
候给你信息反馈啊，哈，真的很感谢 ：） |
