r*****5 发帖数: 1876 | 1 哪位大狭做过啊,能不能指教下啊, 引物的设计有什么特别要求么?
主要是不会算到底是单拷贝还是双拷贝,
谢谢指教啊!! |
w******n 发帖数: 767 | 2 误差很大,为什么不检基因组,跨删除区pcr,根据条带大小,很容易区分-/-,-/+
【在 r*****5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 哪位大狭做过啊,能不能指教下啊, 引物的设计有什么特别要求么? : 主要是不会算到底是单拷贝还是双拷贝, : 谢谢指教啊!!
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r*****5 发帖数: 1876 | 3 谢谢指导, 我就是准备跨基因组, 问题是不确定要3PRIMER 一起用,还是两个两个
用啊?
谢谢 :) |
r*****5 发帖数: 1876 | 4 你的意思是说,跨基因组的话,就可以提取基因组DNA, 然后用普通PCR就可以,对么?
这样可以确定 有没有KNOCKOUT, 但是不能确定是不是+/_, 我的理解对么? |
D*a 发帖数: 6830 | 5 为啥要RT PCR?
啥叫跨基因组?
你的mouse breeding 是咋设定的?是tissue specific KO? 还是传统KO或者hetero
交配 wt? |
w******n 发帖数: 767 | 6 电泳后,+/+是一条较大的带,+/-是一大一小,-/-是一条较小的带。
么?
【在 r*****5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你的意思是说,跨基因组的话,就可以提取基因组DNA, 然后用普通PCR就可以,对么? : 这样可以确定 有没有KNOCKOUT, 但是不能确定是不是+/_, 我的理解对么?
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D*a 发帖数: 6830 | 7 或者也可以设计三个引物,triplex PCR
这样的好处是带的大小可以比较一致,不会出现类似WT大带1000,KO小带200bp 的情况。
【在 w******n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 电泳后,+/+是一条较大的带,+/-是一大一小,-/-是一条较小的带。 : : 么?
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r*****5 发帖数: 1876 | 8 非常感谢啊, 那就是说要3个PRIMER 一起加, 而不是像普通PCR 那样只用2个
PRIMER,用来做PCR, 对么?
【在 w******n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 电泳后,+/+是一条较大的带,+/-是一大一小,-/-是一条较小的带。 : : 么?
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r*****5 发帖数: 1876 | 9 我和人家要的老鼠, 传统的KNOCKOUT ,不是组织特意的
【在 D*a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 为啥要RT PCR? : 啥叫跨基因组? : 你的mouse breeding 是咋设定的?是tissue specific KO? 还是传统KO或者hetero : 交配 wt?
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r*****5 发帖数: 1876 | 10 能具体说说什么 是triplex PCR, 我都没有听说过,哈,谢拉
况。
【在 D*a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 或者也可以设计三个引物,triplex PCR : 这样的好处是带的大小可以比较一致,不会出现类似WT大带1000,KO小带200bp 的情况。
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l**********1 发帖数: 5204 | 11 Exactly,
Please go to
//www.biotechniques.com/multimedia/archive/00010/01315rr05_10077a.pdf
it shown that complete genotyping of a floxed locus is possible with three appropriately placed primers
and that this triplex PCR can be performed simulta- neously with a universal PCR assay for the detection of
Cre transgenes.
[回复]
[ 8 ]
发信人: robin95 (robin95), 信区: Biology
标 题: Re: 请教用REAL-TIME PCR 测定基因KNOCKOUT 小鼠是-/- 还
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Feb 16 11:31:37 2012, 美东)
>非常感谢啊, 那就是说要3个PRIMER 一起加, 而不是像普通PCR 那样只用2个
>PRIMER,用来做PCR, 对么?
【在 w******n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 电泳后,+/+是一条较大的带,+/-是一大一小,-/-是一条较小的带。 : : 么?
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D*a 发帖数: 6830 | 12 你既然不是组织特异的Ko。pcr就很好做了,因为就是KO allele 和WT allele 分别。
genomic PCR 就可以了。回家了不方便发帖, 明天去了实验室给你找个图。 |
l**********1 发帖数: 5204 | 13 that 图 where?
【在 D*a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你既然不是组织特异的Ko。pcr就很好做了,因为就是KO allele 和WT allele 分别。 : genomic PCR 就可以了。回家了不方便发帖, 明天去了实验室给你找个图。
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D*a 发帖数: 6830 | 14 中间那个蓝的你也可以跟红的配对,把它反过来设计。这个看你的基因组序列了。必须
要三个引物的退火温度差不多才能都放到一起用。
我们还再加几对其他的引物测其他的transgene,比如cre啥的,也都放到一个program
里面,一次PCR就都有了。
flox啥的你要是不知道自己查查吧。
【在 r*****5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 能具体说说什么 是triplex PCR, 我都没有听说过,哈,谢拉 : : 况。
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l**********1 发帖数: 5204 | 15 >: flox啥的你要是不知道自己查查吧。
Just go to
//en.wikipedia.org/wiki/Cre-Lox_recombination
//en.wikipedia.org/wiki/Floxed
ps:
又学了一招 Merci Dua.
program
【在 D*a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 中间那个蓝的你也可以跟红的配对,把它反过来设计。这个看你的基因组序列了。必须 : 要三个引物的退火温度差不多才能都放到一起用。 : 我们还再加几对其他的引物测其他的transgene,比如cre啥的,也都放到一个program : 里面,一次PCR就都有了。 : flox啥的你要是不知道自己查查吧。
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r*****5 发帖数: 1876 | 16 真的非常感谢啊, Dua :)
讲的很清楚啊,很实用, 给我们老鼠的人的PAPER 里有3个PRIMER, 他们也说了,WT
和KO 应该是多大片段, 我一直不确定怎么两个两个来选PRIMER, 现在知道了是3
个一起用,谢啦,
还有一个问题, 给我们老鼠的人都设计了3个引物了,不知道他们为什么还有
SOUTHERN 来做, 在文章里他们只显示了SOUTHERN 结果,而没有显示PCR 结果,
SOUTHERN 有什么特别的好处么 ?
program
【在 D*a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 中间那个蓝的你也可以跟红的配对,把它反过来设计。这个看你的基因组序列了。必须 : 要三个引物的退火温度差不多才能都放到一起用。 : 我们还再加几对其他的引物测其他的transgene,比如cre啥的,也都放到一个program : 里面,一次PCR就都有了。 : flox啥的你要是不知道自己查查吧。
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r*****5 发帖数: 1876 | 17 这文章也很好啊, 我原来一点不懂,没有做过, 谢谢指导,继续学习 :)
three appropriately placed primers
universal PCR assay for the detection of
【在 l**********1 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Exactly, : Please go to : //www.biotechniques.com/multimedia/archive/00010/01315rr05_10077a.pdf : it shown that complete genotyping of a floxed locus is possible with three appropriately placed primers : and that this triplex PCR can be performed simulta- neously with a universal PCR assay for the detection of : Cre transgenes. : [回复] : [ 8 ] : 发信人: robin95 (robin95), 信区: Biology : 标 题: Re: 请教用REAL-TIME PCR 测定基因KNOCKOUT 小鼠是-/- 还
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D*a 发帖数: 6830 | 18 southern是把关,PCR有假阳性,再具体的我也不知道了,只知道做老鼠的时候选老鼠
必须要southern。
但是老鼠做完了以后再正常breeding就没必要southern拉。
WT
【在 r*****5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 真的非常感谢啊, Dua :) : 讲的很清楚啊,很实用, 给我们老鼠的人的PAPER 里有3个PRIMER, 他们也说了,WT : 和KO 应该是多大片段, 我一直不确定怎么两个两个来选PRIMER, 现在知道了是3 : 个一起用,谢啦, : 还有一个问题, 给我们老鼠的人都设计了3个引物了,不知道他们为什么还有 : SOUTHERN 来做, 在文章里他们只显示了SOUTHERN 结果,而没有显示PCR 结果, : SOUTHERN 有什么特别的好处么 ? : : program
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r*****5 发帖数: 1876 | 19 哦,是这样啊, 那老鼠是人家做好的,我们管人家要的,所以就做PCR 来试试,到时
候给你信息反馈啊,哈,真的很感谢 :) |