s*********t
发帖数: 600 | 1 比如，A蛋白和B蛋白在HEK293里面。
mRNA水平当然能比较，蛋白水平呢？
有没有简单可行的办法，还是没有？ |
y******n
发帖数: 8667 | |
n**8
发帖数: 221 | 3 操作上比较复杂吧。。要有内参，标准曲线， 好像也不特别精确。
分别体外表达A和B，然后纯化，测定蛋白量，然后load不同量的蛋白做WB，同一块胶上
同时跑待测样品（组织或者细胞lysate），根据load蛋白量和WB signal， 做标准曲线
。把待测样品中A和B的wb signal根据标准曲线换算成绝对蛋白量，就可以比较了。
不晓得大侠们有没有其它方法。 |
n**8
发帖数: 221 | 4 mRNA怎么比较？Q-PCR取决于引物PCR效率，northen取决于探针敏感度？
【在 s*********t 的大作中提到】
: 比如，A蛋白和B蛋白在HEK293里面。
: mRNA水平当然能比较，蛋白水平呢？
: 有没有简单可行的办法，还是没有？
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s*********t
发帖数: 600 | 5 嗯嗯，这样好复杂啊。
有别的办法吗？SILAC？
【在 n**8 的大作中提到】
: 操作上比较复杂吧。。要有内参，标准曲线， 好像也不特别精确。
: 分别体外表达A和B，然后纯化，测定蛋白量，然后load不同量的蛋白做WB，同一块胶上
: 同时跑待测样品（组织或者细胞lysate），根据load蛋白量和WB signal， 做标准曲线
: 。把待测样品中A和B的wb signal根据标准曲线换算成绝对蛋白量，就可以比较了。
: 不晓得大侠们有没有其它方法。
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e****s
发帖数: 1125 | 6 你的蛋白有没有tag? Tag的话不需要特别的提纯你的蛋白了，买点便宜的带tag的蛋白
做标准。
【在 s*********t 的大作中提到】
: 嗯嗯，这样好复杂啊。
: 有别的办法吗？SILAC？
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h*******o
发帖数: 4884 | 7 不管是PCR还是western原理都一样
需要建立一个standard curve,然后去比较
问题是,这样的比较有意义吗?
【在 s*********t 的大作中提到】
: 比如，A蛋白和B蛋白在HEK293里面。
: mRNA水平当然能比较，蛋白水平呢？
: 有没有简单可行的办法，还是没有？
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l**********1
发帖数: 5204 | 8 Single cell FRET
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22114669
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20535203
【在 s*********t 的大作中提到】
: 嗯嗯，这样好复杂啊。
: 有别的办法吗？SILAC？
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i***0
发帖数: 160 | |
a*******u
发帖数: 19 | 10 Cell的一篇paper
http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(09)01506-2
的supplementary
Estimation of absolute number of Jarid2 and Jarid1a molecules per ES cell
nucleus.
Purified recombinant Jarid2 fragment a (Figure 2B, details in Table S9)
containing the epitope
recognized by the Jarid2 antibody was used for protein estimation. The
Jarid1a recombinant
protein containing aa191-290 (cat# H00005927-Q01) and the antibody (cat#
H00005927-A01)
recognizing same fragment were purchased from Abnova. Two-fold serial
dilutions of purified
Jarid2 and Jarid1a recombinant proteins at known molar concentrations and a
two-fold serial
dilution of mES nuclear extract whose total protein concentration was
measured using Bradford
assay were separated on SDS PAGE and analyzed by WB. WB signals from the
same
exposure of the same blot (shown in Figure 2H) were compared between
recombinant proteins
and extracts to calculate molar concentration of Jarid2 and Jarid1a in mES
nuclear extracts.
From there, based on the recovery of ~2 mg of total nuclear protein from 108
ES cells, number
of Jarid2 and Jarid1a molecules per cell nucleus was estimated |
l**********1
发帖数: 5204 | 11 SILAC Stable isotope Mass Spectrometry Analysis is more general than that Cell paper used special antibody
labeled for quantitative analysis in proteomics.
【在 a*******u 的大作中提到】
: Cell的一篇paper
: http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(09)01506-2
: 的supplementary
: Estimation of absolute number of Jarid2 and Jarid1a molecules per ES cell
: nucleus.
: Purified recombinant Jarid2 fragment a (Figure 2B, details in Table S9)
: containing the epitope
: recognized by the Jarid2 antibody was used for protein estimation. The
: Jarid1a recombinant
: protein containing aa191-290 (cat# H00005927-Q01) and the antibody (cat#
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