b**********8
发帖数: 349 | 1 最近开始做这个实验，大概流程如下，RSB+0.5% NP-40 分离nuclei，然后用NEB 公司
的 DNase I （浓度分别为0,8,16,32,64,128 Units/ml）在37度切25min，加EDTA(
final conc 5mM)混合后75度10min终止反应，蛋白酶k 56度过夜消化，酚氯仿抽提。取
2ug 基因组DNA跑0.8% TBE 胶，理论上随着DNase I 酶量加大，应该能看到一个DNA逐
渐变碎的过程，可是我做了几次，都只看到一个很微弱的趋势，我现在有两个问题想请
教大家，
1）是否一定要在DNase I 处理后看到一个明显的基因组DNA变碎的趋势？
2）NEB网站上建议的DNase I处理完毕后需要加一定量的的EDTA，再75度10min，但是我
看别的文献里说EDTA是用来保护mRNA不受降解的，适用于做reverse transcription之
前去处RNA样品中残留的基因组DNA。我这个实验里需呀尽量除去RNA，是否可以不加
EDTA而直接做heat inactivation？
请大家帮助，谢谢 | s*****t
发帖数: 107 | 2 DNAase I 这个assay的结果好像是要做southern才能知道的把，光看胶好像没用，不说
明问题。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 最近开始做这个实验，大概流程如下，RSB+0.5% NP-40 分离nuclei，然后用NEB 公司
: 的 DNase I （浓度分别为0,8,16,32,64,128 Units/ml）在37度切25min，加EDTA(
: final conc 5mM)混合后75度10min终止反应，蛋白酶k 56度过夜消化，酚氯仿抽提。取
: 2ug 基因组DNA跑0.8% TBE 胶，理论上随着DNase I 酶量加大，应该能看到一个DNA逐
: 渐变碎的过程，可是我做了几次，都只看到一个很微弱的趋势，我现在有两个问题想请
: 教大家，
: 1）是否一定要在DNase I 处理后看到一个明显的基因组DNA变碎的趋势？
: 2）NEB网站上建议的DNase I处理完毕后需要加一定量的的EDTA，再75度10min，但是我
: 看别的文献里说EDTA是用来保护mRNA不受降解的，适用于做reverse transcription之
: 前去处RNA样品中残留的基因组DNA。我这个实验里需呀尽量除去RNA，是否可以不加
| s******s
发帖数: 13035 | 3 直接加热过程中dnase的活性不好控制，加了edta应该直接灭了。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 最近开始做这个实验，大概流程如下，RSB+0.5% NP-40 分离nuclei，然后用NEB 公司
: 的 DNase I （浓度分别为0,8,16,32,64,128 Units/ml）在37度切25min，加EDTA(
: final conc 5mM)混合后75度10min终止反应，蛋白酶k 56度过夜消化，酚氯仿抽提。取
: 2ug 基因组DNA跑0.8% TBE 胶，理论上随着DNase I 酶量加大，应该能看到一个DNA逐
: 渐变碎的过程，可是我做了几次，都只看到一个很微弱的趋势，我现在有两个问题想请
: 教大家，
: 1）是否一定要在DNase I 处理后看到一个明显的基因组DNA变碎的趋势？
: 2）NEB网站上建议的DNase I处理完毕后需要加一定量的的EDTA，再75度10min，但是我
: 看别的文献里说EDTA是用来保护mRNA不受降解的，适用于做reverse transcription之
: 前去处RNA样品中残留的基因组DNA。我这个实验里需呀尽量除去RNA，是否可以不加
| b**********8
发帖数: 349 | 4 谢谢回复，最终肯定是要做southern 才对。但是我现在的问题是DNase 处理之后，
southtern
blot之前，那个基因组DNA是不是在电泳胶上应该看出明显的逐渐碎裂的趋势？我现在
的样品，即使DNAse 浓度已经高达128U/ml，（类似的paper最高只用到16或者32U/ml）
，可是跑胶后DNA还是集中在最顶上方的一团。【 在 sickcat (sickcat) 的大作中提
到: 】 |
|
