m**********d
发帖数: 137 | 1 之前做过很多lentivirus，都是超速离心virus之后infect细胞，transduction效率都
还不错，这次偷懒没离心，直接用的含有病毒的medium，可是puromycin select一两天
后细胞全死光了，以下是详细的protocol:
vector用的是pBABE-Luc （基于pBABE-puro,只不过也表达luciferase）
293T细胞，养在75cm2 flask里，用lipofectamine2000转染的，包装病毒用的是second
generation packaging system (PAX2,pMD2.G)
分别于转染后48hr和72hr collect medium，过了一下0.45uM的filter，又加了8ug/ml
的polybrene，就加到要transduce的细胞里去了，24hr之后开始puromycin selection
我能想到的问题可能是准备transduce的细胞有点太confluent了，但这也没法解释全死
光的结果，我想很可能是没有病毒包装，高人们帮忙看看这过程中可能是么出了问题 |
F*K
发帖数: 608 | 2 follow your old protocol, and do it again.
second
ml
selection
【在 m**********d 的大作中提到】
: 之前做过很多lentivirus，都是超速离心virus之后infect细胞，transduction效率都
: 还不错，这次偷懒没离心，直接用的含有病毒的medium，可是puromycin select一两天
: 后细胞全死光了，以下是详细的protocol:
: vector用的是pBABE-Luc （基于pBABE-puro,只不过也表达luciferase）
: 293T细胞，养在75cm2 flask里，用lipofectamine2000转染的，包装病毒用的是second
: generation packaging system (PAX2,pMD2.G)
: 分别于转染后48hr和72hr collect medium，过了一下0.45uM的filter，又加了8ug/ml
: 的polybrene，就加到要transduce的细胞里去了，24hr之后开始puromycin selection
: 我能想到的问题可能是准备transduce的细胞有点太confluent了，但这也没法解释全死
: 光的结果，我想很可能是没有病毒包装，高人们帮忙看看这过程中可能是么出了问题
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G******7
发帖数: 1352 | 3 puromycin加太早了，感染2-3天后再筛选
second
ml
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【在 m**********d 的大作中提到】
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: 后细胞全死光了，以下是详细的protocol:
: vector用的是pBABE-Luc （基于pBABE-puro,只不过也表达luciferase）
: 293T细胞，养在75cm2 flask里，用lipofectamine2000转染的，包装病毒用的是second
: generation packaging system (PAX2,pMD2.G)
: 分别于转染后48hr和72hr collect medium，过了一下0.45uM的filter，又加了8ug/ml
: 的polybrene，就加到要transduce的细胞里去了，24hr之后开始puromycin selection
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: 光的结果，我想很可能是没有病毒包装，高人们帮忙看看这过程中可能是么出了问题
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m*****u
发帖数: 15526 | 4 看infect啥细胞了。跟cell cycle有很大关系。肿瘤细胞很快，原代就慢。记得用GFP infect原代骨髓细胞，4,5天镜下才能看出绿来
second
ml
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【在 m**********d 的大作中提到】
: 之前做过很多lentivirus，都是超速离心virus之后infect细胞，transduction效率都
: 还不错，这次偷懒没离心，直接用的含有病毒的medium，可是puromycin select一两天
: 后细胞全死光了，以下是详细的protocol:
: vector用的是pBABE-Luc （基于pBABE-puro,只不过也表达luciferase）
: 293T细胞，养在75cm2 flask里，用lipofectamine2000转染的，包装病毒用的是second
: generation packaging system (PAX2,pMD2.G)
: 分别于转染后48hr和72hr collect medium，过了一下0.45uM的filter，又加了8ug/ml
: 的polybrene，就加到要transduce的细胞里去了，24hr之后开始puromycin selection
: 我能想到的问题可能是准备transduce的细胞有点太confluent了，但这也没法解释全死
: 光的结果，我想很可能是没有病毒包装，高人们帮忙看看这过程中可能是么出了问题
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C**S
发帖数: 522 | 5 pBABE是Retroviral的
second
ml
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【在 m**********d 的大作中提到】
: 之前做过很多lentivirus，都是超速离心virus之后infect细胞，transduction效率都
: 还不错，这次偷懒没离心，直接用的含有病毒的medium，可是puromycin select一两天
: 后细胞全死光了，以下是详细的protocol:
: vector用的是pBABE-Luc （基于pBABE-puro,只不过也表达luciferase）
: 293T细胞，养在75cm2 flask里，用lipofectamine2000转染的，包装病毒用的是second
: generation packaging system (PAX2,pMD2.G)
: 分别于转染后48hr和72hr collect medium，过了一下0.45uM的filter，又加了8ug/ml
: 的polybrene，就加到要transduce的细胞里去了，24hr之后开始puromycin selection
: 我能想到的问题可能是准备transduce的细胞有点太confluent了，但这也没法解释全死
: 光的结果，我想很可能是没有病毒包装，高人们帮忙看看这过程中可能是么出了问题
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m**********d
发帖数: 137 | 6 可lentivirus不也是retrovirus么
【在 C**S 的大作中提到】
: pBABE是Retroviral的
:
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: selection
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s******y
发帖数: 28562 | 7 我也正觉得奇怪呢。
Lenti 和retro是不一样的，lentivirus 即使在细胞不分裂的时候也能感染细胞，
retrovirus 就必须细胞分裂的时候才能成功感染，所以假如target cell 进入
confluent status 发生contact inhibition 之后就会导致效率大大下降
【在 C**S 的大作中提到】
: pBABE是Retroviral的
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s*******d
发帖数: 370 | |
h******e
发帖数: 69 | 9 时间再长一点，我的病毒要48小时后才能看到荧光。 |
z********9
发帖数: 409 | 10 搭车问一下，lentivirus 0.45um 过滤真的必要吗，离心去掉debris,过滤去掉MVBs,
但对于非整合型的病毒，我的理解应该离心一下就行了吧，求教。 |
