s******a
发帖数: 472 | 1 我课题需要在基因组敲入一个片段，关于用genomic southern blot鉴定克隆有几个问
题，请大家指教。
1，是不是最好用PCR策略去对克隆进行预筛选，然后PCR阳性的再去做southern比较好
？实在不敢想象用southern去筛几百个克隆。。。
2，ES细胞克隆长到多大format提DNA够PCR和southern用呢？（对多少细胞能提多少DNA
没有概念）
3，探针是不是越长越好？
4，southern从1975年到现在有不少发展改良，请问目前最敏感的方法是什么？
拜谢。。。 |
m******5
发帖数: 1383 | 2 1,看你用什么PCR，如果是long range PCR， 也就是一端在你片段里，一端在homology
arm 外面的，能p出specific的带，并且sequencing对，那southern可以直接跳过不用
做了。 很多文章都用的这个办法，发表在比较decent的杂志上
如果是片段里面p个带，那没必要p，那只能鉴定出随机重组，大多数长出来的克隆几乎
都是
2，24well plate 50% confluency以上够大多数用途，如果只用PCR 96 well都够
3，不是
4，还是同位素 |
s******a
发帖数: 472 | 3 谢谢。
突然意识到我可能做不了long range PCR。我正在做的两个targeting vector A和B，A
的long arm和short arm分别是7kb和5kb；B则是6kb和3kb。3-5kb的基因组PCR应该很难
P吧？
PS，是不是没有必要整这么长的homologous arm？天真的想法是越长越好。。。
homology
【在 m******5 的大作中提到】
: 1,看你用什么PCR，如果是long range PCR， 也就是一端在你片段里，一端在homology
: arm 外面的，能p出specific的带，并且sequencing对，那southern可以直接跳过不用
: 做了。 很多文章都用的这个办法，发表在比较decent的杂志上
: 如果是片段里面p个带，那没必要p，那只能鉴定出随机重组，大多数长出来的克隆几乎
: 都是
: 2，24well plate 50% confluency以上够大多数用途，如果只用PCR 96 well都够
: 3，不是
: 4，还是同位素
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m******5
发帖数: 1383 | 4 5k和8k都没问题
5k尤其没问题
用LA Taq+ high GC buffer I
引物设计特异一些
关键是你有negative selection marker么？
，A
【在 s******a 的大作中提到】
: 谢谢。
: 突然意识到我可能做不了long range PCR。我正在做的两个targeting vector A和B，A
: 的long arm和short arm分别是7kb和5kb；B则是6kb和3kb。3-5kb的基因组PCR应该很难
: P吧？
: PS，是不是没有必要整这么长的homologous arm？天真的想法是越长越好。。。
:
: homology
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m******5
发帖数: 1383 | 5 有一点忘记补充，long range PCR的主要问题是可能会筛选出混合 mES line， 不过只
要传几代每代的DNA都提出来做个定量PCR就可以确定（粗定量就可以）
，A
【在 s******a 的大作中提到】
: 谢谢。
: 突然意识到我可能做不了long range PCR。我正在做的两个targeting vector A和B，A
: 的long arm和short arm分别是7kb和5kb；B则是6kb和3kb。3-5kb的基因组PCR应该很难
: P吧？
: PS，是不是没有必要整这么长的homologous arm？天真的想法是越长越好。。。
:
: homology
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s******a
发帖数: 472 | 6 是有negative selection marker的，TK。你说的混合mES是说多个位点多拷贝的整合吗？
定量PCR怎么设control怎么normalize呢？
【在 m******5 的大作中提到】
: 5k和8k都没问题
: 5k尤其没问题
: 用LA Taq+ high GC buffer I
: 引物设计特异一些
: 关键是你有negative selection marker么？
:
: ，A
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l**********1
发帖数: 5204 | 7 for your first question:
try triplex PCR:
detail figure about it
just go to
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31635373.html
14th floor
for your next Southern Blotting relative advice,
just ask Dua whom is an expert in this aspect.
DNA
【在 s******a 的大作中提到】
: 我课题需要在基因组敲入一个片段，关于用genomic southern blot鉴定克隆有几个问
: 题，请大家指教。
: 1，是不是最好用PCR策略去对克隆进行预筛选，然后PCR阳性的再去做southern比较好
: ？实在不敢想象用southern去筛几百个克隆。。。
: 2，ES细胞克隆长到多大format提DNA够PCR和southern用呢？（对多少细胞能提多少DNA
: 没有概念）
: 3，探针是不是越长越好？
: 4，southern从1975年到现在有不少发展改良，请问目前最敏感的方法是什么？
: 拜谢。。。
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m******5
发帖数: 1383 | 8 triplex PCR only works for genotyping lines that have been already
characterized
There is basically no way you can tell whether or not it is recombination or
integration by triplex PCR
【在 l**********1 的大作中提到】
: for your first question:
: try triplex PCR:
: detail figure about it
: just go to
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31635373.html
: 14th floor
: for your next Southern Blotting relative advice,
: just ask Dua whom is an expert in this aspect.
:
: DNA
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l**********1
发帖数: 5204 | 9 So LZ can try this: SYBR Green based Real-Time PCR for screening whether or
not that outside gene its recombination or integration into Mouse tissue/
blood etc.
Reference:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3001095/
//www.springerlink.com/content/g1340707682358n8/
or
【在 m******5 的大作中提到】
: triplex PCR only works for genotyping lines that have been already
: characterized
: There is basically no way you can tell whether or not it is recombination or
: integration by triplex PCR
|
m******5
发帖数: 1383 | 10 you are being so out of context
【在 l**********1 的大作中提到】
: So LZ can try this: SYBR Green based Real-Time PCR for screening whether or
: not that outside gene its recombination or integration into Mouse tissue/
: blood etc.
: Reference:
: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3001095/
: //www.springerlink.com/content/g1340707682358n8/
:
: or
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D*a
发帖数: 6830 | 11 应该是先PCR再southern。
我觉得southern还是不要省，听过一个故事，某转基因拉下来它附近的一段基因组序列
，然后一起插到另一个染色体上去了。把他们差点搞疯。。。 |
m******5
发帖数: 1383 | 12 transgene怎么southern?
而且对这种case southern 和long range pcr等价吧
【在 D*a 的大作中提到】
: 应该是先PCR再southern。
: 我觉得southern还是不要省，听过一个故事，某转基因拉下来它附近的一段基因组序列
: ，然后一起插到另一个染色体上去了。把他们差点搞疯。。。
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D*a
发帖数: 6830 | 13 no idea，聊天的时候听来的。。。
【在 m******5 的大作中提到】
: transgene怎么southern?
: 而且对这种case southern 和long range pcr等价吧
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m******5
发帖数: 1383 | 14 我倒是经常听说transgenic project结果做成gene trap project…………
【在 D*a 的大作中提到】
: no idea，聊天的时候听来的。。。
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s******a
发帖数: 472 | 15 这个triplex PCR确实设计很巧妙啊。。。
不过不适合我的问题，如果要证明我的transgene（insert）整合到特定位点，应该把
引物一个设计在transgene上一个在homologous arm外面做muhe提到的long range PCR。
这样至少能保证transgene在targeted locus整合。
【在 l**********1 的大作中提到】
: for your first question:
: try triplex PCR:
: detail figure about it
: just go to
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31635373.html
: 14th floor
: for your next Southern Blotting relative advice,
: just ask Dua whom is an expert in this aspect.
:
: DNA
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s******a
发帖数: 472 | 16 嗯，就是想要能够先PCR，因为southern是老板让必须有的，但是直接用southern筛数
百克隆工作量好大啊。把PCR阳性的再去做southern会省不少事，希望long range PCR
能工作。
【在 D*a 的大作中提到】
: 应该是先PCR再southern。
: 我觉得southern还是不要省，听过一个故事，某转基因拉下来它附近的一段基因组序列
: ，然后一起插到另一个染色体上去了。把他们差点搞疯。。。
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s******a
发帖数: 472 | 17 这是怎么回事呢？ 无心插柳柳成荫啊
【在 m******5 的大作中提到】
: 我倒是经常听说transgenic project结果做成gene trap project…………
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l**********1
发帖数: 5204 | 18 LZ please try plus anyone reporter likes LacZ or similar
Literatures:
1)
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3098885/
or
2)
FTP site //ftp.sanger.ac.uk/pub4/theses/kong/chapter1.pdf
or
384well Long-range PCR
3)
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21677750
full text link:
//www.genome.gov/Pages/Research/DER/KOMP/KOMP-GWAS-GENE-Nature-June%202011.
pdf
its Fig. 5
PCR。
【在 s******a 的大作中提到】
: 这个triplex PCR确实设计很巧妙啊。。。
: 不过不适合我的问题，如果要证明我的transgene（insert）整合到特定位点，应该把
: 引物一个设计在transgene上一个在homologous arm外面做muhe提到的long range PCR。
: 这样至少能保证transgene在targeted locus整合。
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l**********1
发帖数: 5204 | 19 你老板没让你事先设计 reporter+ cassette modified vector 就做plasmid then
BAC transgene to Mouse 啦?
then 要证明Your transgene（insert）整合到特定locus
if yes plus next Long-range PCR does not work well.
return to start point then do below steps or similar steps:
Generation of knockin mice
Bacterial artificial chromosome (BAC) clone RP23-135A18
containing mouse genomic DNA encoding exon 1 of Zeb1 was
digested with PacI/SphI and SphI to yield 7.6-kb and 2.6-kb
homology arms, respectively, for targeting constructs (Figure 6).
Each targeting construct included loxP sites flanking a splice
acceptor site and internal ribosomal entry site (IRES) (pGT1.8IresBgeo,
provided by Austin Smith at University of Edinburgh)
[44], E. coli lacZ, and a reverse-oriented pPGK-neomycin
resistance cassette cloned into the pPNT plasmid
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3183090/
its Fig . 6
回复]
[ 15 ]
发信人: stemidea (stemidea), 信区: Biology
标 题: Re: 关于genotype knock-in mice的疑问
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 23 02:44:09 2012, 美东)
这个triplex PCR确实设计很巧妙啊。。。
不过不适合我的问题，如果要证明我的transgene（insert）整合到特定位点，应该把
引物一个设计在transgene上一个在homologous arm外面做muhe提到的long range PCR。
这样至少能保证transgene在targeted locus整合
---
PCR
【在 s******a 的大作中提到】
: 嗯，就是想要能够先PCR，因为southern是老板让必须有的，但是直接用southern筛数
: 百克隆工作量好大啊。把PCR阳性的再去做southern会省不少事，希望long range PCR
: 能工作。
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l**********1
发帖数: 5204 | 20 楼主 她/他老板是外行 或者放鸭子 让楼主自己胡搞呢
要是后者的话 干脆做这个：
generate a series of transgenic lines including fluorescent mice
if Long-range PCR does not work well:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3001095/
Abstract citation:
Mouse transgenesis has proven invaluable for analysis of gene function and
generation of human disease models. We describe here the development of a
pronuclear injection-based targeted transgenesis (PITT) system, involving
site-specific integration in fertilized eggs. The system was applied to two
different genomic target loci to generate a series of transgenic lines
including fluorescent mice
【在 m******5 的大作中提到】
: you are being so out of context
|
|
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D*a
发帖数: 6830 | 21 如果楼主老板什么都不懂，还是找个懂行的谈谈。
听说很多trick的，虽然具体我也不懂。。。我老板当年倒是一气做了三只老鼠 |
l**********1
发帖数: 5204 | 22 You re right.
Long-range PCR → Southern → FISH
ps:
当时 没看清楚 看成KO+/+ KO-/- strains 了
or
【在 m******5 的大作中提到】
: triplex PCR only works for genotyping lines that have been already
: characterized
: There is basically no way you can tell whether or not it is recombination or
: integration by triplex PCR
|
s******a
发帖数: 472 | 23 I have ordered BACs and done recombineering to obtain modified insert
flanked by homologous arms. The plan is to further introduce a selection
cassette (neo), after which modified insert flanked by homologous arms will
be retrieved into targeting vector with negative selection marker.
And the next step will be ES targeting and transgenic mice generation...But
that's quite far away. Now I am just planning the strategies which I can use
to screen ES clones for correctly targeted insert.
PS, the boss does know something but definitely not the details. So to some
extent, I can 胡搞.
【在 l**********1 的大作中提到】
: 你老板没让你事先设计 reporter+ cassette modified vector 就做plasmid then
: BAC transgene to Mouse 啦?
: then 要证明Your transgene（insert）整合到特定locus
: if yes plus next Long-range PCR does not work well.
: return to start point then do below steps or similar steps:
: Generation of knockin mice
: Bacterial artificial chromosome (BAC) clone RP23-135A18
: containing mouse genomic DNA encoding exon 1 of Zeb1 was
: digested with PacI/SphI and SphI to yield 7.6-kb and 2.6-kb
: homology arms, respectively, for targeting constructs (Figure 6).
|
l**********1
发帖数: 5204 | 24 Then you should ask your Boss and let him/her connect to Dua her Boss(DR)
if your project met further problems.
Good Luck!
will
But
use
some
【在 s******a 的大作中提到】
: I have ordered BACs and done recombineering to obtain modified insert
: flanked by homologous arms. The plan is to further introduce a selection
: cassette (neo), after which modified insert flanked by homologous arms will
: be retrieved into targeting vector with negative selection marker.
: And the next step will be ES targeting and transgenic mice generation...But
: that's quite far away. Now I am just planning the strategies which I can use
: to screen ES clones for correctly targeted insert.
: PS, the boss does know something but definitely not the details. So to some
: extent, I can 胡搞.
|
s******a
发帖数: 472 | 25 Who's her boss?
【在 l**********1 的大作中提到】
: Then you should ask your Boss and let him/her connect to Dua her Boss(DR)
: if your project met further problems.
: Good Luck!
:
: will
: But
: use
: some
|
l**********1
发帖数: 5204 | 26 INSERM (institut national science et recherche medicale) 听名字就是
专做生物和医学
DR; DR就是可以当大老板的了，自己的实验室可以是完全独立的，手下可以招CR，
博后，technicien，等等。
但是法国教育系统有一个规定，一个人只能直接带两个博士生。这个是我硕士的时候老师特别强调的，看好了这个老师
能不能招博士再去申请。其实这个规定到底有多硬我也不知道，我老板带了三个，不过有一个可以算是一个特别的系统
申请上来的，这里不细说了，总之他自己不能再招了，因为博士院那里直接就把他剔除出去当年招人的名单了。所以老
板要想招学生，就要多招CR，然后纸面上CR才是学生的导师。
cited from
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31483587.html
zero floor
Ps: 具体的联系方法 楼主 站内PM Dua 吧 当然不能在bbs上公布这些内容 啊
【在 s******a 的大作中提到】
: Who's her boss?
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s******a
发帖数: 472 | 27 Thanks.
You have references for almost every post.
zan~~~
老师特别强调的，看好了这个老师
过有一个可以算是一个特别的系统
除出去当年招人的名单了。所以老
【在 l**********1 的大作中提到】
: INSERM (institut national science et recherche medicale) 听名字就是
: 专做生物和医学
: DR; DR就是可以当大老板的了，自己的实验室可以是完全独立的，手下可以招CR，
: 博后，technicien，等等。
: 但是法国教育系统有一个规定，一个人只能直接带两个博士生。这个是我硕士的时候老师特别强调的，看好了这个老师
: 能不能招博士再去申请。其实这个规定到底有多硬我也不知道，我老板带了三个，不过有一个可以算是一个特别的系统
: 申请上来的，这里不细说了，总之他自己不能再招了，因为博士院那里直接就把他剔除出去当年招人的名单了。所以老
: 板要想招学生，就要多招CR，然后纸面上CR才是学生的导师。
: cited from
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31483587.html
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i*********0
发帖数: 915 | 28
homology
做一个96well 的 duplicate,一个做Southern + PCR, 一个做backup for southern,
基本上都解决了.
【在 m******5 的大作中提到】
: 1,看你用什么PCR，如果是long range PCR， 也就是一端在你片段里，一端在homology
: arm 外面的，能p出specific的带，并且sequencing对，那southern可以直接跳过不用
: 做了。 很多文章都用的这个办法，发表在比较decent的杂志上
: 如果是片段里面p个带，那没必要p，那只能鉴定出随机重组，大多数长出来的克隆几乎
: 都是
: 2，24well plate 50% confluency以上够大多数用途，如果只用PCR 96 well都够
: 3，不是
: 4，还是同位素
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