l*******c
发帖数: 478 | 1 曾经尝试做DNA片段连入载体，没成功。有人建议说把其中的双酶切那步分成两步做，
后来试了，还是不行。我想稍后把流程贴上来请大家指导。
我想先问一下：做双酶切（BAMH I 和 ECOR I ），两个酶同时切和分成两次切，有很
大区别吗？你们一般怎么做呢？
谢谢大家啦！ |
n***w
发帖数: 2405 | 2 你的两个酶都是一个公司的吗？
这两个酶，我一般就是一起切。 |
I***a
发帖数: 13467 | 3 有的时候不同的酶用不同的buffer，
如果双酶切的buffer对一种酶活性影响很大时，就分开做，
如果影响不大，就一起做。 |
s********r
发帖数: 312 | 4 ECOR I 不是1234四种buffer随便切嘛。跟BAMH I同时切肯定没问题的，我指的是NEB的
酶。
【在 l*******c 的大作中提到】
: 曾经尝试做DNA片段连入载体，没成功。有人建议说把其中的双酶切那步分成两步做，
: 后来试了，还是不行。我想稍后把流程贴上来请大家指导。
: 我想先问一下：做双酶切（BAMH I 和 ECOR I ），两个酶同时切和分成两次切，有很
: 大区别吗？你们一般怎么做呢？
: 谢谢大家啦！
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s******s
发帖数: 13035 | 5 这两个超级烂酶怎么切都没问题。你还是查查序列对不对，留没留足够的长度
【在 l*******c 的大作中提到】
: 曾经尝试做DNA片段连入载体，没成功。有人建议说把其中的双酶切那步分成两步做，
: 后来试了，还是不行。我想稍后把流程贴上来请大家指导。
: 我想先问一下：做双酶切（BAMH I 和 ECOR I ），两个酶同时切和分成两次切，有很
: 大区别吗？你们一般怎么做呢？
: 谢谢大家啦！
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l*******c
发帖数: 478 | 6 哈哈哈，SHAKURAS你太幽默了！
谢谢楼上大家的鼎力相助哈，太好了，看来我有望解开当年的谜了。
我顺便把酶切的反应量列出来，大家看看。都是FERMENTAS的。
我想问：双酶切对两种酶量的比例有没讲究？
ddH2O 30UL
DNA 7UL
10XTANGO 10UL
BAMH I 2UL
ECOR I 1UL |
l*******c
发帖数: 478 | 7 还有，SHAKURAS你说的留没留足够的长度是什么意思？ |
s********r
发帖数: 312 | |
l*******c
发帖数: 478 | |
b******s
发帖数: 1089 | 10 虽说理论上这两个酶在大部分buffer里活性都不错。但实际上并不一定所有的组合都好
用。
尤其是有时候在非最佳的buffer里会有star acticity。如果同时做双酶切出现问题，
可以考虑做sequential digestion。你不必每步都抽提，可以先用离子浓度低的buffer
第一个酶先切，然后换成离子浓度高的buffer，用第二个酶切。如果切的时间足够长，
酶量足的话，我觉得不一定要加CIP，这样会促进其后的连接效率。
【在 l*******c 的大作中提到】
: 曾经尝试做DNA片段连入载体，没成功。有人建议说把其中的双酶切那步分成两步做，
: 后来试了，还是不行。我想稍后把流程贴上来请大家指导。
: 我想先问一下：做双酶切（BAMH I 和 ECOR I ），两个酶同时切和分成两次切，有很
: 大区别吗？你们一般怎么做呢？
: 谢谢大家啦！
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a*****a
发帖数: 415 | |
a*****a
发帖数: 415 | 12 fermentas的酶没用过
neb的用 neb double digest finder查
ecori和bamhi如果都是HFversion的可以用buffer 4做double digest
bamhi如果不是hf version最好在buffer3切，不然star activity强 |
x**2
发帖数: 255 | 13 你这个50ul的总体积放了10ul的10xbuffer?
【在 l*******c 的大作中提到】
: 哈哈哈，SHAKURAS你太幽默了！
: 谢谢楼上大家的鼎力相助哈，太好了，看来我有望解开当年的谜了。
: 我顺便把酶切的反应量列出来，大家看看。都是FERMENTAS的。
: 我想问：双酶切对两种酶量的比例有没讲究？
: ddH2O 30UL
: DNA 7UL
: 10XTANGO 10UL
: BAMH I 2UL
: ECOR I 1UL
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t**m
发帖数: 158 | 14 天知道你的DNA用了多少量...
另外, 10ul 10xbuffer in 50ul?
【在 l*******c 的大作中提到】
: 哈哈哈，SHAKURAS你太幽默了！
: 谢谢楼上大家的鼎力相助哈，太好了，看来我有望解开当年的谜了。
: 我顺便把酶切的反应量列出来，大家看看。都是FERMENTAS的。
: 我想问：双酶切对两种酶量的比例有没讲究？
: ddH2O 30UL
: DNA 7UL
: 10XTANGO 10UL
: BAMH I 2UL
: ECOR I 1UL
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n***w
发帖数: 2405 | |
l*******c
发帖数: 478 | 16 阿，那个BUFFER应该是粗心大意啦，汗。。。非常感谢大家，我又查了下当年记录，其它次
BUFFER没有出错，还是没连上。
稍后我准备把整个连接过程整理出来请大家指正。 |
l*******c
发帖数: 478 | 17 to tfmm和ntgxw，DNA的浓度我还得找下当年记录，只记得是按有经验的人建议的量取的。
请问，你们做双酶切一般选择多少ng的DNA？谢谢。 |
b******s
发帖数: 1089 | 18 限制性内切酶里是有glycerol的，浓度太高会影响酶切反应。两个酶体积加起来最好不
要超过整个反应体系的20%。你以前链接没成果原因很多。试试不加CIP处理，延长酶切
时间看看。
取的。
【在 l*******c 的大作中提到】
: to tfmm和ntgxw，DNA的浓度我还得找下当年记录，只记得是按有经验的人建议的量取的。
: 请问，你们做双酶切一般选择多少ng的DNA？谢谢。
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l*******c
发帖数: 478 | 19 谢谢。是的，我一直靠自己摸索，感觉影响连接的因素很多，很希望能解开当年这个谜
团，总觉得做一件事要有头有尾。非常感谢你。
【在 b******s 的大作中提到】
: 限制性内切酶里是有glycerol的，浓度太高会影响酶切反应。两个酶体积加起来最好不
: 要超过整个反应体系的20%。你以前链接没成果原因很多。试试不加CIP处理，延长酶切
: 时间看看。
:
: 取的。
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x*****e
发帖数: 309 | 20 建议1.看看酶活性单位的定义，One unit is defined as the amount of enzyme
required to digest 1 µg of λ DNA in 1 hour at 37°C in a total
reaction volume of 50 µl. 切超螺旋质粒提高到5-10倍。确定你加的酶足够，
但不要超过总体积的1/10； 2.看看两个酶切位点之间距离是否大于6nt，小于还是选其
他酶吧。3.如果不能同时切，可以先用低盐buffer,切好后再补NaCl变成高盐buffer,加
第二个酶。 Good luck! 其实如果是刚要来的质粒，怎么切都不行的话，还是测序吧。 |
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z*h
发帖数: 773 | 21 Try Simple Cloning. Only PCR, without restriction enzyme and ligase, no kit,
no special host.
http://aem.asm.org/content/early/2011/12/16/AEM.07105-11.short? |
s*****g
发帖数: 87 | 22 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
s*****g
发帖数: 87 | 23 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
s*****g
发帖数: 87 | 24 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
