C******d
发帖数: 362 | 1 刚做real-time PCR，遇见了一个大问题，待高手解答，先谢谢了！
我的样品没有扩增曲线，但gel显示band is there.
PCR 反应溶液组分：
DNA 2 uL, 50-150 ng， 260/280 都在1.8-2.1之间
taqman probe: 2 pmol
primers: 4 pmol
master mix: 10 ul
总共： 20 uL
real-time PCR 仪器是：Stratagene Mx3000
昨天和合成probe的公司联系，说可能要加DMSO，今天就加了5%，结果同样是没有扩增
曲线？
primer和probe，都是按文献设计做的。莫非是仪器设置的问题？还是其他莫名原因？
跪谢！！！！ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 有两个可能：
１。你的样品里加了荧光染料了么？
２。最近有人在这个机器上做过么？他们能不能看到他们的荧光信号？
【在 C******d 的大作中提到】
: 刚做real-time PCR，遇见了一个大问题，待高手解答，先谢谢了！
: 我的样品没有扩增曲线，但gel显示band is there.
: PCR 反应溶液组分：
: DNA 2 uL, 50-150 ng， 260/280 都在1.8-2.1之间
: taqman probe: 2 pmol
: primers: 4 pmol
: master mix: 10 ul
: 总共： 20 uL
: real-time PCR 仪器是：Stratagene Mx3000
: 昨天和合成probe的公司联系，说可能要加DMSO，今天就加了5%，结果同样是没有扩增
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h*******o
发帖数: 4884 | 3 Taqman probe is fluorescent with a quencher.
【在 s******y 的大作中提到】
: 有两个可能：
: １。你的样品里加了荧光染料了么？
: ２。最近有人在这个机器上做过么？他们能不能看到他们的荧光信号？
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g***y
发帖数: 201 | 4 你的positive control 怎么样呢？
【在 C******d 的大作中提到】
: 刚做real-time PCR，遇见了一个大问题，待高手解答，先谢谢了！
: 我的样品没有扩增曲线，但gel显示band is there.
: PCR 反应溶液组分：
: DNA 2 uL, 50-150 ng， 260/280 都在1.8-2.1之间
: taqman probe: 2 pmol
: primers: 4 pmol
: master mix: 10 ul
: 总共： 20 uL
: real-time PCR 仪器是：Stratagene Mx3000
: 昨天和合成probe的公司联系，说可能要加DMSO，今天就加了5%，结果同样是没有扩增
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v***2
发帖数: 131 | 5 which type of fluorescence for Taqman probe? Fam? Vicor? cy5...
and what is your setting in machine? which step do you collect data?
More possible,it is your real time PCR instrument setting problem |
C******d
发帖数: 362 | 6 另一组primer和probe的设计，我做出了比较好的标准曲线。
【在 s******y 的大作中提到】
: 有两个可能：
: １。你的样品里加了荧光染料了么？
: ２。最近有人在这个机器上做过么？他们能不能看到他们的荧光信号？
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C******d
发帖数: 362 | 7 我没用positive control
【在 g***y 的大作中提到】
: 你的positive control 怎么样呢？
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C******d
发帖数: 362 | 8 reporter dye: 6-FAM
Quencher: TAMRA
I collect data at the end of annealing.
我设定的检测信号：ROX和FAM， ROX is reference
这些天，我就只准备了两个样品，一个NTC，一个添加了cDNA的，看是否能得到扩增曲
线，但结果都总是没有，我还改变了probe的浓度
仪器设置上，你觉得还有哪些应该注意的？谢谢
【在 v***2 的大作中提到】
: which type of fluorescence for Taqman probe? Fam? Vicor? cy5...
: and what is your setting in machine? which step do you collect data?
: More possible,it is your real time PCR instrument setting problem
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d****7
发帖数: 2241 | 9
【在 C******d 的大作中提到】
: 刚做real-time PCR，遇见了一个大问题，待高手解答，先谢谢了！
: 我的样品没有扩增曲线，但gel显示band is there.
: PCR 反应溶液组分：
: DNA 2 uL, 50-150 ng， 260/280 都在1.8-2.1之间
: taqman probe: 2 pmol
: primers: 4 pmol
: master mix: 10 ul
: 总共： 20 uL
: real-time PCR 仪器是：Stratagene Mx3000
: 昨天和合成probe的公司联系，说可能要加DMSO，今天就加了5%，结果同样是没有扩增
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c*******n
发帖数: 27 | 10 Check if your master mix contains the Rox dye. The machine can't determine
the baseline if there is no Rox dye, and you got no amplification curve.
【在 C******d 的大作中提到】
: reporter dye: 6-FAM
: Quencher: TAMRA
: I collect data at the end of annealing.
: 我设定的检测信号：ROX和FAM， ROX is reference
: 这些天，我就只准备了两个样品，一个NTC，一个添加了cDNA的，看是否能得到扩增曲
: 线，但结果都总是没有，我还改变了probe的浓度
: 仪器设置上，你觉得还有哪些应该注意的？谢谢
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g*********5
发帖数: 2533 | 11 要么，先试试beta actin? 如果这个不出来，染料有问题？
不过你的产物跑过胶。条带浓亮吗？ |
C******d
发帖数: 362 | 12 谢谢啊
胶带不浓亮，比较暗。有时NTC样品，也有些更暗的胶带。
但是，我用常规PCR，试了下，得到很浓亮的胶带，只是常规PCR中，primer的浓度高很多
【在 g*********5 的大作中提到】
: 要么，先试试beta actin? 如果这个不出来，染料有问题？
: 不过你的产物跑过胶。条带浓亮吗？
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C******d
发帖数: 362 | 13 我把产品说明书看了，确实有ROX dye
如果NTC的样品被污染，是不是也可能得不到扩增曲线？
【在 c*******n 的大作中提到】
: Check if your master mix contains the Rox dye. The machine can't determine
: the baseline if there is no Rox dye, and you got no amplification curve.
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A*******e
发帖数: 284 | 14 用的啥机器作的阿，很明显是检测荧光那步出了问题。要不是机器硬件问题，就是你设
置那步检测荧光出了问题。仔细查查你的设置把 不是PCR的问题 |
C******d
发帖数: 362 | 15 谢谢建议
机子是Stratagene Mx3000
设置，应该注意些什么？ |
A*******e
发帖数: 284 | 16 很久不用taqman了 几乎忘了原理,你说你是在annealing后面收集荧光. 你用的机器我
没有用过,不清楚具体设置.你用的是两步法还是三步法. 尝试三步法在延伸后面收集荧
光.taqman好像依赖taq酶的外切酶活性对吧. |
