g*********3
发帖数: 177 | 1 新手上路，可能问题对各位比较简单~
先谢谢了
我现在的目的蛋白在质粒里，有stop codon，接下来有两个目的
1）在N- & C-terminal 加各种tag，50a.a左右
2）把蛋白克隆到lentivirus里去
请问各位最好的流程是怎样的，现在各种纠结啊～
谢谢大家 |
s******s
发帖数: 13035 | 2 你要找一个gateway的virus，不过不知道全setup一遍要花多少心思，
反正以后再做tag就方便了。你基因多大啊
【在 g*********3 的大作中提到】
: 新手上路，可能问题对各位比较简单~
: 先谢谢了
: 我现在的目的蛋白在质粒里，有stop codon，接下来有两个目的
: 1）在N- & C-terminal 加各种tag，50a.a左右
: 2）把蛋白克隆到lentivirus里去
: 请问各位最好的流程是怎样的，现在各种纠结啊～
: 谢谢大家
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l******g
发帖数: 1145 | 3 50aa的tag的话，直接挂引物上有点太大了，我没有试过。
你要加的tag如果已经在其他质粒里的话，要么直接切，要么pcr带酶切位点扩增出来后
，先subcloning到lentivirus的表达载体里，一事两便，靠近5’和3’的msc各做一个
。5’的那个记得要有start codon。这两个质粒，以后可以用来放其他要tag的蛋白。
在克隆好带tag的lentivirus质粒后，再用pcr带酶切位点扩增你的目标蛋白，然后
subcloning进去。
注意：
1.在5’加tag的话，如果有现成酶切位点可以利用的话，可以直接subclone，不用pcr
的话，可以减少mutation的几率。
2. 3’加tag，扩增目标蛋白时，记得把stop codon去掉。
3.设计流程时，千万注意最后蛋白和tag是in frame的（连在后面的那个）！！ |
s******s
发帖数: 13035 | 4 现代化的分子克隆方法介绍
1. Gateway系统
这个很多lab在用了，swap不同的domain非常方便，适用于加不同tag,
用不同promoter，换不同的plasmid，好处是快速方便，不用考虑reading frame
2. Gibson Assembly
两条双链DNA，只要有20－30bp的overlap, 加点NEB的master mix，就能变成一条。
3. IDT的Gblock
500bp合成只要$99，配合Gibson assembly对付小片段克隆无敌，对付大片段可以
部分pcr，部分gblock(比如tag的部分)
【在 g*********3 的大作中提到】
: 新手上路，可能问题对各位比较简单~
: 先谢谢了
: 我现在的目的蛋白在质粒里，有stop codon，接下来有两个目的
: 1）在N- & C-terminal 加各种tag，50a.a左右
: 2）把蛋白克隆到lentivirus里去
: 请问各位最好的流程是怎样的，现在各种纠结啊～
: 谢谢大家
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s******s
发帖数: 13035 | 5 这个我总结一下，基本上Gibson Assembly就不用subcloning了，所有
片段组装都直接在solution里面一次完成；Gblock的出现让所有小片段的
克隆全没有意义，完全可以廉价快速合成。
【在 s******s 的大作中提到】
: 现代化的分子克隆方法介绍
: 1. Gateway系统
: 这个很多lab在用了，swap不同的domain非常方便，适用于加不同tag,
: 用不同promoter，换不同的plasmid，好处是快速方便，不用考虑reading frame
: 2. Gibson Assembly
: 两条双链DNA，只要有20－30bp的overlap, 加点NEB的master mix，就能变成一条。
: 3. IDT的Gblock
: 500bp合成只要$99，配合Gibson assembly对付小片段克隆无敌，对付大片段可以
: 部分pcr，部分gblock(比如tag的部分)
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g*********3
发帖数: 177 | 6 我的基因不是很大 500a.a左右
谢谢！
【在 s******s 的大作中提到】
: 这个我总结一下，基本上Gibson Assembly就不用subcloning了，所有
: 片段组装都直接在solution里面一次完成；Gblock的出现让所有小片段的
: 克隆全没有意义，完全可以廉价快速合成。
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g*********5
发帖数: 2533 | 7 这个不就是其他公司的infusion吗？
【在 s******s 的大作中提到】
: 这个我总结一下，基本上Gibson Assembly就不用subcloning了，所有
: 片段组装都直接在solution里面一次完成；Gblock的出现让所有小片段的
: 克隆全没有意义，完全可以廉价快速合成。
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