g*********3 发帖数: 177 | 1 新手上路,可能问题对各位比较简单~
先谢谢了
我现在的目的蛋白在质粒里,有stop codon,接下来有两个目的
1)在N- & C-terminal 加各种tag,50a.a左右
2)把蛋白克隆到lentivirus里去
请问各位最好的流程是怎样的,现在各种纠结啊~
谢谢大家 |
s******s 发帖数: 13035 | 2 你要找一个gateway的virus,不过不知道全setup一遍要花多少心思,
反正以后再做tag就方便了。你基因多大啊
【在 g*********3 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 新手上路,可能问题对各位比较简单~ : 先谢谢了 : 我现在的目的蛋白在质粒里,有stop codon,接下来有两个目的 : 1)在N- & C-terminal 加各种tag,50a.a左右 : 2)把蛋白克隆到lentivirus里去 : 请问各位最好的流程是怎样的,现在各种纠结啊~ : 谢谢大家
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l******g 发帖数: 1145 | 3 50aa的tag的话,直接挂引物上有点太大了,我没有试过。
你要加的tag如果已经在其他质粒里的话,要么直接切,要么pcr带酶切位点扩增出来后
,先subcloning到lentivirus的表达载体里,一事两便,靠近5’和3’的msc各做一个
。5’的那个记得要有start codon。这两个质粒,以后可以用来放其他要tag的蛋白。
在克隆好带tag的lentivirus质粒后,再用pcr带酶切位点扩增你的目标蛋白,然后
subcloning进去。
注意:
1.在5’加tag的话,如果有现成酶切位点可以利用的话,可以直接subclone,不用pcr
的话,可以减少mutation的几率。
2. 3’加tag,扩增目标蛋白时,记得把stop codon去掉。
3.设计流程时,千万注意最后蛋白和tag是in frame的(连在后面的那个)!! |
s******s 发帖数: 13035 | 4 现代化的分子克隆方法介绍
1. Gateway系统
这个很多lab在用了,swap不同的domain非常方便,适用于加不同tag,
用不同promoter,换不同的plasmid,好处是快速方便,不用考虑reading frame
2. Gibson Assembly
两条双链DNA,只要有20-30bp的overlap, 加点NEB的master mix,就能变成一条。
3. IDT的Gblock
500bp合成只要$99,配合Gibson assembly对付小片段克隆无敌,对付大片段可以
部分pcr,部分gblock(比如tag的部分)
【在 g*********3 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 新手上路,可能问题对各位比较简单~ : 先谢谢了 : 我现在的目的蛋白在质粒里,有stop codon,接下来有两个目的 : 1)在N- & C-terminal 加各种tag,50a.a左右 : 2)把蛋白克隆到lentivirus里去 : 请问各位最好的流程是怎样的,现在各种纠结啊~ : 谢谢大家
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s******s 发帖数: 13035 | 5 这个我总结一下,基本上Gibson Assembly就不用subcloning了,所有
片段组装都直接在solution里面一次完成;Gblock的出现让所有小片段的
克隆全没有意义,完全可以廉价快速合成。
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 现代化的分子克隆方法介绍 : 1. Gateway系统 : 这个很多lab在用了,swap不同的domain非常方便,适用于加不同tag, : 用不同promoter,换不同的plasmid,好处是快速方便,不用考虑reading frame : 2. Gibson Assembly : 两条双链DNA,只要有20-30bp的overlap, 加点NEB的master mix,就能变成一条。 : 3. IDT的Gblock : 500bp合成只要$99,配合Gibson assembly对付小片段克隆无敌,对付大片段可以 : 部分pcr,部分gblock(比如tag的部分)
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g*********3 发帖数: 177 | 6 我的基因不是很大 500a.a左右
谢谢!
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个我总结一下,基本上Gibson Assembly就不用subcloning了,所有 : 片段组装都直接在solution里面一次完成;Gblock的出现让所有小片段的 : 克隆全没有意义,完全可以廉价快速合成。
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g*********5 发帖数: 2533 | 7 这个不就是其他公司的infusion吗?
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个我总结一下,基本上Gibson Assembly就不用subcloning了,所有 : 片段组装都直接在solution里面一次完成;Gblock的出现让所有小片段的 : 克隆全没有意义,完全可以廉价快速合成。
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