b******s
发帖数: 1089 | 1 我做了好几个不同的tag: YFP，CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光，但连其他
蛋白的时候，偶尔有荧光，但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS，大约15aa的样子
。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker，是不是加了这样的linker大部分情况
下都好用，还是也要看不同蛋白的特性？ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 是的，一般都是用亲水氨基酸，以防止被误折叠到fusion protein 里面去
【在 b******s 的大作中提到】
: 我做了好几个不同的tag: YFP，CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光，但连其他
: 蛋白的时候，偶尔有荧光，但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS，大约15aa的样子
: 。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker，是不是加了这样的linker大部分情况
: 下都好用，还是也要看不同蛋白的特性？
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b******s
发帖数: 1089 | 3 文献上有各种各样的linker.
能不能推荐一个好的linker？最好试验过很多蛋白的。谢谢！
【在 s******y 的大作中提到】
: 是的，一般都是用亲水氨基酸，以防止被误折叠到fusion protein 里面去
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b******s
发帖数: 1089 | 4 我先给几个我从文献上看来的linker总结：
很早就有人用十个alanine做linker，后来有人用十个glycine-alanine重复做linker，
再后来有人用flexible亲水linker（GEGQGQGQGPGRGYAYRS），公司卖的载体有GGGGGA做
linker的。
有谁用过的谈谈经验？谢谢
【在 b******s 的大作中提到】
: 文献上有各种各样的linker.
: 能不能推荐一个好的linker？最好试验过很多蛋白的。谢谢！
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K*C
发帖数: 2825 | 5 GGGGS linker很好，还可以重复以增加长度。
Ke, D. and Tu, S.-C. (2011) Activities, kinetics and emission spectra of
bacterial luciferase-fluorescent Protein fusion enzymes. Photochemistry and
Photobiology
87: 1346–1353.
【在 b******s 的大作中提到】
: 我先给几个我从文献上看来的linker总结：
: 很早就有人用十个alanine做linker，后来有人用十个glycine-alanine重复做linker，
: 再后来有人用flexible亲水linker（GEGQGQGQGPGRGYAYRS），公司卖的载体有GGGGGA做
: linker的。
: 有谁用过的谈谈经验？谢谢
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c********b
发帖数: 363 | 6 其实我觉得不一定是linker的问题，表达量出问题的可能性更大。
你是做的转基因还是transient 表达？一般我都是先在烟草里面agro-infiltrate试过
之后才做转基因，protoplast也OK，但是麻烦些。
我不同的蛋白连同样的linker（比如说pK7FGW2.0里面的那个GFP linker），表达量相
差10-50被是很经常的事情。有的用35S promoter表达好，有的用inducible （
estrogen）表达好。加不加RNA silencing suppressor差别也很大。有的蛋白老叶子新
叶子都能表达，有的只能在新叶子上表达。
与其在linker上折腾（估计也很难找到万能的），你试试agro-infiltration，用P19做
co-infiltration，这个算是做简单的了。
【在 b******s 的大作中提到】
: 我做了好几个不同的tag: YFP，CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光，但连其他
: 蛋白的时候，偶尔有荧光，但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS，大约15aa的样子
: 。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker，是不是加了这样的linker大部分情况
: 下都好用，还是也要看不同蛋白的特性？
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s********x
发帖数: 472 | 7 没有荧光不是linker的问题，如果表达后定位不对或者聚积才有可能是linker的问题，
GFP折叠非常有效，不会被什么linker弄死，倒是你的目标蛋白，因为带上这个大东西
可能会出问题。
俺做了几十个FP fusion，还没有遇到没有无荧光的问题（可能会导致蛋白聚积）。
如果你确信DNA seq没有错的话，就只能是你的蛋白表达不好了，换个tag做western试
试吧。
【在 b******s 的大作中提到】
: 我做了好几个不同的tag: YFP，CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光，但连其他
: 蛋白的时候，偶尔有荧光，但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS，大约15aa的样子
: 。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker，是不是加了这样的linker大部分情况
: 下都好用，还是也要看不同蛋白的特性？
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n********k
发帖数: 2818 | 8 what about your protein half life? how about to let it go for a longer time.
..there was once we had to wait for several days before we see nice GFP,,,I
still don't get it why...
【在 b******s 的大作中提到】
: 我做了好几个不同的tag: YFP，CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光，但连其他
: 蛋白的时候，偶尔有荧光，但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS，大约15aa的样子
: 。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker，是不是加了这样的linker大部分情况
: 下都好用，还是也要看不同蛋白的特性？
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