b******s 发帖数: 1089 | 1 我做了好几个不同的tag: YFP,CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光,但连其他
蛋白的时候,偶尔有荧光,但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS,大约15aa的样子
。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker,是不是加了这样的linker大部分情况
下都好用,还是也要看不同蛋白的特性? |
s******y 发帖数: 28562 | 2 是的,一般都是用亲水氨基酸,以防止被误折叠到fusion protein 里面去
【在 b******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我做了好几个不同的tag: YFP,CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光,但连其他 : 蛋白的时候,偶尔有荧光,但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS,大约15aa的样子 : 。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker,是不是加了这样的linker大部分情况 : 下都好用,还是也要看不同蛋白的特性?
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b******s 发帖数: 1089 | 3 文献上有各种各样的linker.
能不能推荐一个好的linker?最好试验过很多蛋白的。谢谢!
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 是的,一般都是用亲水氨基酸,以防止被误折叠到fusion protein 里面去
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b******s 发帖数: 1089 | 4 我先给几个我从文献上看来的linker总结:
很早就有人用十个alanine做linker,后来有人用十个glycine-alanine重复做linker,
再后来有人用flexible亲水linker(GEGQGQGQGPGRGYAYRS),公司卖的载体有GGGGGA做
linker的。
有谁用过的谈谈经验?谢谢
【在 b******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 文献上有各种各样的linker. : 能不能推荐一个好的linker?最好试验过很多蛋白的。谢谢!
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K*C 发帖数: 2825 | 5 GGGGS linker很好,还可以重复以增加长度。
Ke, D. and Tu, S.-C. (2011) Activities, kinetics and emission spectra of
bacterial luciferase-fluorescent Protein fusion enzymes. Photochemistry and
Photobiology
87: 1346–1353.
【在 b******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我先给几个我从文献上看来的linker总结: : 很早就有人用十个alanine做linker,后来有人用十个glycine-alanine重复做linker, : 再后来有人用flexible亲水linker(GEGQGQGQGPGRGYAYRS),公司卖的载体有GGGGGA做 : linker的。 : 有谁用过的谈谈经验?谢谢
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c********b 发帖数: 363 | 6 其实我觉得不一定是linker的问题,表达量出问题的可能性更大。
你是做的转基因还是transient 表达?一般我都是先在烟草里面agro-infiltrate试过
之后才做转基因,protoplast也OK,但是麻烦些。
我不同的蛋白连同样的linker(比如说pK7FGW2.0里面的那个GFP linker),表达量相
差10-50被是很经常的事情。有的用35S promoter表达好,有的用inducible (
estrogen)表达好。加不加RNA silencing suppressor差别也很大。有的蛋白老叶子新
叶子都能表达,有的只能在新叶子上表达。
与其在linker上折腾(估计也很难找到万能的),你试试agro-infiltration,用P19做
co-infiltration,这个算是做简单的了。
【在 b******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我做了好几个不同的tag: YFP,CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光,但连其他 : 蛋白的时候,偶尔有荧光,但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS,大约15aa的样子 : 。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker,是不是加了这样的linker大部分情况 : 下都好用,还是也要看不同蛋白的特性?
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s********x 发帖数: 472 | 7 没有荧光不是linker的问题,如果表达后定位不对或者聚积才有可能是linker的问题,
GFP折叠非常有效,不会被什么linker弄死,倒是你的目标蛋白,因为带上这个大东西
可能会出问题。
俺做了几十个FP fusion,还没有遇到没有无荧光的问题(可能会导致蛋白聚积)。
如果你确信DNA seq没有错的话,就只能是你的蛋白表达不好了,换个tag做western试
试吧。
【在 b******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我做了好几个不同的tag: YFP,CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光,但连其他 : 蛋白的时候,偶尔有荧光,但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS,大约15aa的样子 : 。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker,是不是加了这样的linker大部分情况 : 下都好用,还是也要看不同蛋白的特性?
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n********k 发帖数: 2818 | 8 what about your protein half life? how about to let it go for a longer time.
..there was once we had to wait for several days before we see nice GFP,,,I
still don't get it why...
【在 b******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我做了好几个不同的tag: YFP,CFP, mcherry等。用histone试全部有荧光,但连其他 : 蛋白的时候,偶尔有荧光,但很多都没有。蛋白和tag中间隔的是MCS,大约15aa的样子 : 。我看很多其他的载体还做了专门的亲水linker,是不是加了这样的linker大部分情况 : 下都好用,还是也要看不同蛋白的特性?
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