H****n
发帖数: 26 | 1 自己折腾了好久，还是解决不了问题，只好来版上请教大牛了。
DNA shearing to 150-700 bp, Input DNA 量是～100ug，抗体用Abcam的anti-HA （
ChIP grade， 5ug for each IP）
抗体结合的buffer 配方是（ChIP dilution buffer： 20mMTrisHC PH8.0， EDTA PH8.
0 2mM, NaCl 150mM, SDS 0.01%, TritonX-100 1%）. 抗体incubate Overnight,
millipore的beads用dilution buffer 洗三遍，然后BSA block overnight 第二天加进
去，3-4hours.
还有，做的是tissue的ChIP（表达这个TF的细胞只占细胞总数的8%-10%），为了让固定
的1%甲醛渗透更快点，用tripsin消化了
组织（之前直接用SDS裂解组织也做过，效果也不好），固定10min.
wash： 1 low salt ->1 high salt->1 LiCL suffer->2* TE
问题: 1. 没有TF banding 的地方， anti-HA 和 anti-IgG都能扩出带。
2. 理论有TF banding的地方， anti-HA拉下的带和anti-IgG 相比基本没有加强
（可能有加强一点）。
3. 这个HA抗体比较tricky， 同时做了一组anti-polII，和anti-IgG相比，能拉
下很多TATAbox region.
看一些材料说可以优化binding buffer 盐浓度,让抗体结合的更好点，但是没有经验，
不知道如何改.另外，其他的改进方法都还有那些？ 不甚感激！！！ |
G********e
发帖数: 528 | 2 我觉得你做的tissue ChIP比我做的是相当高级了，没有直接的经验，不过有一些擦边
的想法
Most likely，你已经指出来实验的问题了，在第三点
你用polii可以拉下来很多，但是这个抗体不行
说明你的ChIP过程是work的，至少对好的抗体来讲。
还有一个问题是信号强度的问题，有可能却是是这个TF在体内信号很低
是否可以考虑同时做个对照，拿已知的可以有很强binding的system
比如说体外培养的细胞，大家公认这个TF在某个promoter有很强的binding
拿着个来作为positive control
如果阳性对照出来了，这个tissue的还做不出来，那有可能却是没有cell culture那么
强的binding，或许体内和体外就是不一样。
有没有试过qPCR来定量分析？
如果你的polii用的是mouse igG2a的8wg16，我觉得它是一个非常好的抗体
在TATA和基因外区域，有些时候可以得到好几百倍的信号差异
所以我觉得qPCR可能会有帮助提高resolution
你的IgGChIP是什么IgG，是否和HA的抗体是同类，还是和PolII同类？
如果不是同类的，可能不能作为negative control
我不确定不同的IgG对tissueChIP是否会有高的背景 |
G********e
发帖数: 528 | |
l********s
发帖数: 70 | 4 我们可以讨论，这两天在做CHIP，你买 Cell singalling 的beads，我觉得挺好用。里
面把bsa什么的都是ready to use
另外我建议，用1mm glass beads 在计入125mM glycine 以后，打晕组织再次，打个6
次，中间休息1-2min 放在冰上。 trypsine 可以不用。 我这里些个protocol 可以给
你，07年nature protocol 有个 fast chip 你就可以借鉴
qq 53671616 |
H****n
发帖数: 26 | 5 多谢你的的回复！
我的positive control就是用anti-polII 拉下GAPDH的 TATA box region. 另外，我的
anti-HA 和 IgG都是Rabbit的，是否IgG这里会产生背景？
现在我在设计Q-PCR的引物，具体看看定量。老板还要我用这个模型做ChIP-seq，现在
这个enrichment的效果真让我不敢想象。
PS：我自己做了一个Knock-in 的老鼠，让那个TF带有HA fusion.
欢迎继续交流！
【在 G********e 的大作中提到】
: 我觉得你做的tissue ChIP比我做的是相当高级了，没有直接的经验，不过有一些擦边
: 的想法
: Most likely，你已经指出来实验的问题了，在第三点
: 你用polii可以拉下来很多，但是这个抗体不行
: 说明你的ChIP过程是work的，至少对好的抗体来讲。
: 还有一个问题是信号强度的问题，有可能却是是这个TF在体内信号很低
: 是否可以考虑同时做个对照，拿已知的可以有很强binding的system
: 比如说体外培养的细胞，大家公认这个TF在某个promoter有很强的binding
: 拿着个来作为positive control
: 如果阳性对照出来了，这个tissue的还做不出来，那有可能却是没有cell culture那么
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H****n
发帖数: 26 | 6 多谢beads的信息。其实我也怀疑这个milipore 的beads不给力。已发送qq好友申请。
呵呵。
6
【在 l********s 的大作中提到】
: 我们可以讨论，这两天在做CHIP，你买 Cell singalling 的beads，我觉得挺好用。里
: 面把bsa什么的都是ready to use
: 另外我建议，用1mm glass beads 在计入125mM glycine 以后，打晕组织再次，打个6
: 次，中间休息1-2min 放在冰上。 trypsine 可以不用。 我这里些个protocol 可以给
: 你，07年nature protocol 有个 fast chip 你就可以借鉴
: qq 53671616
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w***a
发帖数: 1053 | 7 我是直接买的millipore的试剂盒
感觉用的很好
不过我得抗体是高浓度chip专用的 |
n********k
发帖数: 2818 | 8 换抗体！抗体好， everything rocks! Ab sucks, nothing works!
PH8.
【在 H****n 的大作中提到】
: 自己折腾了好久，还是解决不了问题，只好来版上请教大牛了。
: DNA shearing to 150-700 bp, Input DNA 量是～100ug，抗体用Abcam的anti-HA （
: ChIP grade， 5ug for each IP）
: 抗体结合的buffer 配方是（ChIP dilution buffer： 20mMTrisHC PH8.0， EDTA PH8.
: 0 2mM, NaCl 150mM, SDS 0.01%, TritonX-100 1%）. 抗体incubate Overnight,
: millipore的beads用dilution buffer 洗三遍，然后BSA block overnight 第二天加进
: 去，3-4hours.
: 还有，做的是tissue的ChIP（表达这个TF的细胞只占细胞总数的8%-10%），为了让固定
: 的1%甲醛渗透更快点，用tripsin消化了
: 组织（之前直接用SDS裂解组织也做过，效果也不好），固定10min.
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H****n
发帖数: 26 | 9 请问 anti-HA 的ChIP抗体哪家的好？
【在 n********k 的大作中提到】
: 换抗体！抗体好， everything rocks! Ab sucks, nothing works!
:
: PH8.
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G********e
发帖数: 528 | 10 你这个positive control是CHIP过程的control，可以说明实验本身没问题
我说的那个是Ab的control，可以说明那个抗体可靠
如果这两个都做出来了，不管你得到什么样的结果都是非常solid
完全可以相信自己做出来的结果，不管别的人做出来什么样子，估计老板也无话可说
rabbit的IgG我在mouse tissue上做过，信号很低
ChIP-seq好啊，会得到比较全面的结果
【在 H****n 的大作中提到】
: 多谢你的的回复！
: 我的positive control就是用anti-polII 拉下GAPDH的 TATA box region. 另外，我的
: anti-HA 和 IgG都是Rabbit的，是否IgG这里会产生背景？
: 现在我在设计Q-PCR的引物，具体看看定量。老板还要我用这个模型做ChIP-seq，现在
: 这个enrichment的效果真让我不敢想象。
: PS：我自己做了一个Knock-in 的老鼠，让那个TF带有HA fusion.
: 欢迎继续交流！
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n********k
发帖数: 2818 | 11 I don't know but I know Ab is likely the No1 factor for ChIP, esp ChIP-seq,
so when buy antibody, look for ChIP-Seq grade or verified...
【在 H****n 的大作中提到】
: 请问 anti-HA 的ChIP抗体哪家的好？
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H****n
发帖数: 26 | 12 懂你说的control的意思。
另外，你说的 rabbit的IgG在mouse tissue上信号很低，意思是我可以用这个IgG来做
背景对照了是么？
（还是说我的anti-HA Ab是Rabbit的对mouse protein结合很低，要换）
Thx
【在 G********e 的大作中提到】
: 你这个positive control是CHIP过程的control，可以说明实验本身没问题
: 我说的那个是Ab的control，可以说明那个抗体可靠
: 如果这两个都做出来了，不管你得到什么样的结果都是非常solid
: 完全可以相信自己做出来的结果，不管别的人做出来什么样子，估计老板也无话可说
: rabbit的IgG我在mouse tissue上做过，信号很低
: ChIP-seq好啊，会得到比较全面的结果
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G********e
发帖数: 528 | 13 我没有做成功过tissue的，不好下结论，猜测可能洗不干净，不过你的wash过程也没太
大问题。
你觉得tissue的ChIP和in vitro培养的cells的ChIP做起来有什么不同吗？
我最近也打算尝试tissue的ChIP |
