l****j
发帖数: 70 | 1 MEF cell，第一代长的很好，
第二代就长的乱七八糟了，形态都不太规则，有大有小，还有多核的，有的都不像
fibroblast了
我完全照着protocol做的，medium里都加mercaptoethanol了
Current Protocols in Molecular Biology (2005) 28.1.1-28.1.8
UNIT 28.1
Preparation, Culture, and Immortalization of Mouse Embryonic Fibroblasts
有人有类似情况吗？
MEF cell怎么能长得好？ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 正常，因为有些细胞出现了分裂障碍。
多分几代，分到大概7~8代的时候，那些乱七八糟的细胞就因为不能正常分裂而死光了。
【在 l****j 的大作中提到】
: MEF cell，第一代长的很好，
: 第二代就长的乱七八糟了，形态都不太规则，有大有小，还有多核的，有的都不像
: fibroblast了
: 我完全照着protocol做的，medium里都加mercaptoethanol了
: Current Protocols in Molecular Biology (2005) 28.1.1-28.1.8
: UNIT 28.1
: Preparation, Culture, and Immortalization of Mouse Embryonic Fibroblasts
: 有人有类似情况吗？
: MEF cell怎么能长得好？
|
h******y
发帖数: 351 | 3 如果你的MEF是用作feeder的话，不建议用超过6代的细胞。
MEF对ROS很敏感，传代过多，MEF会自发immortalization。
分MEF最简单的办法是把组织挤过18-20G的针头，然后trypsin 3-5 分钟。MEF的培养液
中不需要加b-ME.
了。
【在 s******y 的大作中提到】
: 正常，因为有些细胞出现了分裂障碍。
: 多分几代，分到大概7~8代的时候，那些乱七八糟的细胞就因为不能正常分裂而死光了。
|
s******y
发帖数: 28562 | 4 恩，你这个补充的很好，我不知道楼主分离那个是想干什么用的，如果是
用来进行immortalization，可以不管不顾地继续传代，传到下面就出现
形态正常的细胞了。但是如果是作为feeder 的话，只要功能在那里，形态
无所谓的。
【在 h******y 的大作中提到】
: 如果你的MEF是用作feeder的话，不建议用超过6代的细胞。
: MEF对ROS很敏感，传代过多，MEF会自发immortalization。
: 分MEF最简单的办法是把组织挤过18-20G的针头，然后trypsin 3-5 分钟。MEF的培养液
: 中不需要加b-ME.
:
: 了。
|
m***g
发帖数: 197 | 5 我也正好有各相关的问题，一直困扰着。
问别的试验室要了一对MEF （wt和ko的），我想immortalize它，因为以后想经常用到
。我就打算一直传。
问题是，那个细胞长的特别慢，有的细胞拉伸的特别长，而且经常有死细胞悬浮。我只
好2天换一次DMEM（+FBS）。因为细胞数目越养越少，现在从要来之后从一个大flask传
到小flask，细胞密度与日俱减，真担心再过几个星期就养死了！
有没有什么挽救的办法？谢谢。我就这么“不管不顾”的传，可以么？需要额外添加的
什么东西能让细胞长的happy点么？ |
h******y
发帖数: 351 | 6 MEF在20%氧气的培养条件下，很快（6-8个passage以后）就会停止生长。 这是因为MEF
对reactive oxygen species很敏感，由此引起的DNA damage激活p53以及其他信号（正
常生长因子和matrix缺失等）激活p16-Rb通路，引起senescence。你应该问一下他们给
你的MEF的passage，最好要到分离后第1或第2代的细胞，这样你还能用几代。
但是如果你把这些停止生长的细胞保留着（不要传代），过几个星期你会发现细胞又长
起来了，而且越长越好，这就是自发immortalized的细胞。很多MEF细胞系就是这样建立
起来的，例如著名的3T3系列。但是我不建议你用这些immortalized的MEF做实验，因为
上述ROS引起DNA damage的原因，这些自发immortalized的MEF已经产生太多基因变异（
因为需要bypass p53和p16-Rb两个重要通路的抑制），即使你看到表型的差异，也很难
说是你的gene KO的结果。
如果确实需要长久使用MEF，一是拿到老鼠，分离新鲜的MEF做实验。二是利用低氧（3-
5%）条件培养MEF。
这篇文章你可以参考一下
Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibrob
lasts
Nature Cell Biology 5, 741 - 747 (2003)
http://www.nature.com/ncb/journal/v5/n8/full/ncb1024.html
【在 m***g 的大作中提到】
: 我也正好有各相关的问题，一直困扰着。
: 问别的试验室要了一对MEF （wt和ko的），我想immortalize它，因为以后想经常用到
: 。我就打算一直传。
: 问题是，那个细胞长的特别慢，有的细胞拉伸的特别长，而且经常有死细胞悬浮。我只
: 好2天换一次DMEM（+FBS）。因为细胞数目越养越少，现在从要来之后从一个大flask传
: 到小flask，细胞密度与日俱减，真担心再过几个星期就养死了！
: 有没有什么挽救的办法？谢谢。我就这么“不管不顾”的传，可以么？需要额外添加的
: 什么东西能让细胞长的happy点么？
|
a****c
发帖数: 339 | 7 我用primary MEF,理论上只用passage 5之前的，根据实际情况有时候p6也能用，有时
候p3看着就完了。
有些实验室用T-antigen 做immortalization。不过我们老板死活不让用，非常郁闷。 |
m***g
发帖数: 197 | 8 非常感谢，
我用的是普通培养箱5% CO2.
目前不担心它对信号通路的影响，就是想得到可以经常稳定传代的细胞。因为是从费劲
要到这个细胞。所以，只能自己immortalize了
MEF
建立
【在 h******y 的大作中提到】
: MEF在20%氧气的培养条件下，很快（6-8个passage以后）就会停止生长。 这是因为MEF
: 对reactive oxygen species很敏感，由此引起的DNA damage激活p53以及其他信号（正
: 常生长因子和matrix缺失等）激活p16-Rb通路，引起senescence。你应该问一下他们给
: 你的MEF的passage，最好要到分离后第1或第2代的细胞，这样你还能用几代。
: 但是如果你把这些停止生长的细胞保留着（不要传代），过几个星期你会发现细胞又长
: 起来了，而且越长越好，这就是自发immortalized的细胞。很多MEF细胞系就是这样建立
: 起来的，例如著名的3T3系列。但是我不建议你用这些immortalized的MEF做实验，因为
: 上述ROS引起DNA damage的原因，这些自发immortalized的MEF已经产生太多基因变异（
: 因为需要bypass p53和p16-Rb两个重要通路的抑制），即使你看到表型的差异，也很难
: 说是你的gene KO的结果。
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h******y
发帖数: 351 | 9 sv40 T will inhibit p53, so it can be used to immortalize MEF
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【在 a****c 的大作中提到】
: 我用primary MEF,理论上只用passage 5之前的，根据实际情况有时候p6也能用，有时
: 候p3看着就完了。
: 有些实验室用T-antigen 做immortalization。不过我们老板死活不让用，非常郁闷。
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h******y
发帖数: 351 | 10 What do you want to do with the MEFs? Can you elaborate more
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【在 m***g 的大作中提到】
: 非常感谢，
: 我用的是普通培养箱5% CO2.
: 目前不担心它对信号通路的影响，就是想得到可以经常稳定传代的细胞。因为是从费劲
: 要到这个细胞。所以，只能自己immortalize了
:
: MEF
: 建立
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m***g
发帖数: 197 | 11 是这样的，要看一个酶的有和无，对他下游蛋白功能的影响。
不想用knockdown，因为这个酶很强大，有一点残留都会起作用。
KO是最理想的了。
他们给我们的这一对MEF，都是长的慢，死的多。我们没有其他immortalize的经验和质
粒，只好用这个传代的方法。
如果我不断的传代，到底会完全死掉，还是会有重生进而稳定生长的机会？
【在 h******y 的大作中提到】
: What do you want to do with the MEFs? Can you elaborate more
:
: [发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com]
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s******s
发帖数: 13035 | 12 印象里会小鼠细胞会自发delete某一段chromosome, 然后immortalize。
记得就小鼠这样。human啥的可能要bypass两个通路，所以很少
【在 m***g 的大作中提到】
: 是这样的，要看一个酶的有和无，对他下游蛋白功能的影响。
: 不想用knockdown，因为这个酶很强大，有一点残留都会起作用。
: KO是最理想的了。
: 他们给我们的这一对MEF，都是长的慢，死的多。我们没有其他immortalize的经验和质
: 粒，只好用这个传代的方法。
: 如果我不断的传代，到底会完全死掉，还是会有重生进而稳定生长的机会？
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D*a
发帖数: 6830 | 13 非要用immortalized细胞么？你把一到2代的细胞冻起来，慢慢用不行么？ |
h******y
发帖数: 351 | 14 不明白你为什么一定要用immortalized的MEF。因为上述MEF需要克服p53和Rb两个通路
对细胞分裂的共同抑制，MEF需要产生很多基因突变，所以自发immortalization的几率
很小。如何你想同时获得immortalized的野生型和KO的MEF，你的两株细胞的各自
immortalization是两个独立的事件，即使你能获得immortalized的细胞株，他们之间
也已经不能作为参照了。
【在 m***g 的大作中提到】
: 是这样的，要看一个酶的有和无，对他下游蛋白功能的影响。
: 不想用knockdown，因为这个酶很强大，有一点残留都会起作用。
: KO是最理想的了。
: 他们给我们的这一对MEF，都是长的慢，死的多。我们没有其他immortalize的经验和质
: 粒，只好用这个传代的方法。
: 如果我不断的传代，到底会完全死掉，还是会有重生进而稳定生长的机会？
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u**********d
发帖数: 573 | 15 听起来好生动啊，ROS这么牛，MEF这么菜
MEF
建立
【在 h******y 的大作中提到】
: MEF在20%氧气的培养条件下，很快（6-8个passage以后）就会停止生长。 这是因为MEF
: 对reactive oxygen species很敏感，由此引起的DNA damage激活p53以及其他信号（正
: 常生长因子和matrix缺失等）激活p16-Rb通路，引起senescence。你应该问一下他们给
: 你的MEF的passage，最好要到分离后第1或第2代的细胞，这样你还能用几代。
: 但是如果你把这些停止生长的细胞保留着（不要传代），过几个星期你会发现细胞又长
: 起来了，而且越长越好，这就是自发immortalized的细胞。很多MEF细胞系就是这样建立
: 起来的，例如著名的3T3系列。但是我不建议你用这些immortalized的MEF做实验，因为
: 上述ROS引起DNA damage的原因，这些自发immortalized的MEF已经产生太多基因变异（
: 因为需要bypass p53和p16-Rb两个重要通路的抑制），即使你看到表型的差异，也很难
: 说是你的gene KO的结果。
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l****j
发帖数: 70 | 16 我是分别从wt和ko mouse embryo 中分离的MEF cell,不是用来做feeder，
敲除的基因能在 ER stress，apoptosis，autophagy 中起作用，
我有overexpression的细胞系，但还想用MEF cell 做类似的实验，其他人发表的文章
用过MEF cell，我也想试试。
【在 s******y 的大作中提到】
: 恩，你这个补充的很好，我不知道楼主分离那个是想干什么用的，如果是
: 用来进行immortalization，可以不管不顾地继续传代，传到下面就出现
: 形态正常的细胞了。但是如果是作为feeder 的话，只要功能在那里，形态
: 无所谓的。
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l****j
发帖数: 70 | 17 低氧的环境下会不会对我要研究的蛋白质有影响？
MEF
建立
【在 h******y 的大作中提到】
: MEF在20%氧气的培养条件下，很快（6-8个passage以后）就会停止生长。 这是因为MEF
: 对reactive oxygen species很敏感，由此引起的DNA damage激活p53以及其他信号（正
: 常生长因子和matrix缺失等）激活p16-Rb通路，引起senescence。你应该问一下他们给
: 你的MEF的passage，最好要到分离后第1或第2代的细胞，这样你还能用几代。
: 但是如果你把这些停止生长的细胞保留着（不要传代），过几个星期你会发现细胞又长
: 起来了，而且越长越好，这就是自发immortalized的细胞。很多MEF细胞系就是这样建立
: 起来的，例如著名的3T3系列。但是我不建议你用这些immortalized的MEF做实验，因为
: 上述ROS引起DNA damage的原因，这些自发immortalized的MEF已经产生太多基因变异（
: 因为需要bypass p53和p16-Rb两个重要通路的抑制），即使你看到表型的差异，也很难
: 说是你的gene KO的结果。
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l****j
发帖数: 70 | 18 我确实想要长久使用MEF,
请问新鲜的MEF是指在20% 氧气吗？可以最多传几代？
如果是低氧能传到第几代呢？能一直养下去吗？
如果确实需要长久使用MEF，一是拿到老鼠，分离新鲜的MEF做实验。二是利用低氧（3-
5%）条件培养MEF。
【在 h******y 的大作中提到】
: 不明白你为什么一定要用immortalized的MEF。因为上述MEF需要克服p53和Rb两个通路
: 对细胞分裂的共同抑制，MEF需要产生很多基因突变，所以自发immortalization的几率
: 很小。如何你想同时获得immortalized的野生型和KO的MEF，你的两株细胞的各自
: immortalization是两个独立的事件，即使你能获得immortalized的细胞株，他们之间
: 也已经不能作为参照了。
|
D*a
发帖数: 6830 | 19 低氧环境才是体内正常环境。
【在 l****j 的大作中提到】
: 低氧的环境下会不会对我要研究的蛋白质有影响？
:
: MEF
: 建立
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s******y
发帖数: 28562 | 20 你说的这些道理大家都明白，但是没有任何一个实验系统是完美的。
对于用immortalized细胞系做的实验，关键就是要做rescue实验进行对照，
在此前提下（有正确对照）做出来的结果还是能够得到认可的，很多文章
就是这么发表的。
其他方法，包括RNA knockdown, or molecular inhibitors, 都各有各的缺陷，
并不一定就比这个好。所以比较严谨的文章会同时用几种方法来重复
一些关键试验。
【在 h******y 的大作中提到】
: 不明白你为什么一定要用immortalized的MEF。因为上述MEF需要克服p53和Rb两个通路
: 对细胞分裂的共同抑制，MEF需要产生很多基因突变，所以自发immortalization的几率
: 很小。如何你想同时获得immortalized的野生型和KO的MEF，你的两株细胞的各自
: immortalization是两个独立的事件，即使你能获得immortalized的细胞株，他们之间
: 也已经不能作为参照了。
|
|
|
w***a
发帖数: 1053 | 21 我见过有人加一些生长因子
长的很好
就是那些东西都比较贵 |
h******y
发帖数: 351 | 22 If you culture MEF under 20% oxygen, then it is the best to use cells before
passage 6 (please keep in mind that the best seeding density of MEF is
about 5000/cm2.)
If you culture the MEFs under 3-5% Oxygen, you can go up to 50 passages.
Huge difference as you can see.
3-
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【在 l****j 的大作中提到】
: 我确实想要长久使用MEF,
: 请问新鲜的MEF是指在20% 氧气吗？可以最多传几代？
: 如果是低氧能传到第几代呢？能一直养下去吗？
:
: 如果确实需要长久使用MEF，一是拿到老鼠，分离新鲜的MEF做实验。二是利用低氧（3-
: 5%）条件培养MEF。
|
h******y
发帖数: 351 | 23 In your case, I think you might want to try different protocol. A good
protocol should yield nice MEF culture from the wildtype embryo at least.
The most important thing is to avoid overdigestion with trypsin, which will
always leads to poor culture.
[发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com]
【在 l****j 的大作中提到】
: 我是分别从wt和ko mouse embryo 中分离的MEF cell,不是用来做feeder，
: 敲除的基因能在 ER stress，apoptosis，autophagy 中起作用，
: 我有overexpression的细胞系，但还想用MEF cell 做类似的实验，其他人发表的文章
: 用过MEF cell，我也想试试。
|
h******y
发帖数: 351 | 24 Good point.
This is exactly right.
LZ need to think about other experiments that can corroborate any findings
from this paired immortalization experiment.
[发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com]
【在 s******y 的大作中提到】
: 你说的这些道理大家都明白，但是没有任何一个实验系统是完美的。
: 对于用immortalized细胞系做的实验，关键就是要做rescue实验进行对照，
: 在此前提下（有正确对照）做出来的结果还是能够得到认可的，很多文章
: 就是这么发表的。
: 其他方法，包括RNA knockdown, or molecular inhibitors, 都各有各的缺陷，
: 并不一定就比这个好。所以比较严谨的文章会同时用几种方法来重复
: 一些关键试验。
|
s******y
发帖数: 28562 | 25 对了，你有没有最新的比较温和而成功率又比较高的immortalization MEF的方法？
我们合作者那里有一个新的cell line, 他们用3T3 protocol 试图了好几次都没有
成功。现在我实在是等不及了，打算自己来诱导，但是既然他们没有成功，可能
我们也不一定能成功。
findings
【在 h******y 的大作中提到】
: Good point.
: This is exactly right.
: LZ need to think about other experiments that can corroborate any findings
: from this paired immortalization experiment.
:
: [发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com]
|
m*****z
发帖数: 1451 | 26 加b-Me不是为了减少ROS吗？
【在 h******y 的大作中提到】
: 如果你的MEF是用作feeder的话，不建议用超过6代的细胞。
: MEF对ROS很敏感，传代过多，MEF会自发immortalization。
: 分MEF最简单的办法是把组织挤过18-20G的针头，然后trypsin 3-5 分钟。MEF的培养液
: 中不需要加b-ME.
:
: 了。
|
l****j
发帖数: 70 | 27 我follow的protocol说，b-ME 是为了创造一个还原条件，防止细胞分化。
【在 m*****z 的大作中提到】
: 加b-Me不是为了减少ROS吗？
|
l****j
发帖数: 70 | 28 我找的protocol上用的是0.25% trypsin在 4C overnight让trypsin完全浸入组织,然后
在 37C 30min 消化分离第一代，之后传代都用0.05% trypsin，但消化很困难，所以我
用了0.1%的trypsin,这样是会过度消化吗？
will
【在 h******y 的大作中提到】
: In your case, I think you might want to try different protocol. A good
: protocol should yield nice MEF culture from the wildtype embryo at least.
: The most important thing is to avoid overdigestion with trypsin, which will
: always leads to poor culture.
:
: [发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com]
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l****j
发帖数: 70 | 29 我见过有人就用的wt MEF 然后转染shRNA做成KO,但是只有80%左右ko了。
findings
【在 h******y 的大作中提到】
: Good point.
: This is exactly right.
: LZ need to think about other experiments that can corroborate any findings
: from this paired immortalization experiment.
:
: [发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com]
|
m*****z
发帖数: 1451 | 30 养MEF，防止分化？
我一直以为是降低ROS
【在 l****j 的大作中提到】
: 我follow的protocol说，b-ME 是为了创造一个还原条件，防止细胞分化。
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m*****z
发帖数: 1451 | 31 取embryo，去头和内脏，剪碎，0.25% trypsin 37oC消化10分钟，seed在10cm盘，3-4
天传代
一直这么做没问题，不过从来没有handle过比较神奇的MEF就是了。
【在 l****j 的大作中提到】
: 我找的protocol上用的是0.25% trypsin在 4C overnight让trypsin完全浸入组织,然后
: 在 37C 30min 消化分离第一代，之后传代都用0.05% trypsin，但消化很困难，所以我
: 用了0.1%的trypsin,这样是会过度消化吗？
:
: will
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h******y
发帖数: 351 | 32 你这消化的时间太长了。
我的方法给你参考。
E13.5或E14.5，去头去内脏，转到一个预先装有0.25%Trypsin-0.53mM EDTA的3mL注射
器里，从20G的针头中挤过。如果组织块太大的话，多挤几次。然后在37C消化5分钟。
用FBS终止酶消化，离心收集组织和细胞，用5mL pipette重悬。每1-2个胚胎可以铺一
个10cm的dish。一两天后就长满了，这算P0。需要注意的是所有和组织接触的塑料器皿
用前需要先润湿，否则组织很容易粘到上面。
传代用0.25%Trypsin-0.53mMEDTA，37C，3-5分钟。这算P1。从这里起，seeding
density在4-5 X 10^3/cm2. 3-4天或者接近长满的时候分一次。一般在第2或3次的时候
冻足够多的细胞，1x10^6/vial. 运气好的话，一只孕鼠的6-8个胚胎分出来的MEF足够
你用的了。
【在 l****j 的大作中提到】
: 我找的protocol上用的是0.25% trypsin在 4C overnight让trypsin完全浸入组织,然后
: 在 37C 30min 消化分离第一代，之后传代都用0.05% trypsin，但消化很困难，所以我
: 用了0.1%的trypsin,这样是会过度消化吗？
:
: will
|
h******y
发帖数: 351 | 33 你说的比较温和是指什么？
来源于很多组织的人的fibroblast可以通过overexpress hTERT得到immortalization，
这是由于人的fibroblast在体外培养条件下的senescence多是由于端粒渐行缩短而导致
的（telomere-dependent replicative senescence）。与人的fibroblast不同，体外
培养中MEF的senescence并不是由于端粒缩短引起的,而是由于如前所述的过氧基团累积
oxidative stress induced DNA damage。研究表明senescence的MEF的端粒还很长，而
且MEF中有较高的mTERT表达，所以过表达mTERT并不能有效immortalize MEF。因为要抑
制p53和Rb通路，所以表达异源的SV40 T和HPV16 E6/E7都可以immortalize MEF。当然
这样得到的细胞株，由于这些病毒蛋白的过量表达，基因组并不稳定，长久培养会出现
嬗变。
3T3办法引起的自发immortalization实际上主要是由于自发的p53通路抑制（p53 loss
or p19 loss)。或者你研究的基因/通路补偿了p53或者p19的缺失，所以很难得到
immortalized的细胞株？
3T3方法我自己没有用过，从文献里照抄一段供参考。
D. Immortalization by Serial Passage
1. Split MEFs 1:3 twice per week during the rapid
growth phase of the culture (the first 6-10 passages).
2. As cells enter senescence, split 1:2 or merely
replate (aim to keep cells near 100% confluency on
the day of passaging). If the cultures are seeded
too sparsely, this will decrease the immortalization
frequency.
3. Between passages 10 and 20 (4 to 9 week in
culture), immortalized lines will begin to overgrow the
culture. These cells are smaller and spindle shaped,
initially appearing as small nests of cells obvious
on the day of passaging. These cells can be subcloned,
but are used more frequently as pooled immortalized
cells.
【在 s******y 的大作中提到】
: 对了，你有没有最新的比较温和而成功率又比较高的immortalization MEF的方法？
: 我们合作者那里有一个新的cell line, 他们用3T3 protocol 试图了好几次都没有
: 成功。现在我实在是等不及了，打算自己来诱导，但是既然他们没有成功，可能
: 我们也不一定能成功。
:
: findings
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s******y
发帖数: 28562 | 34 谢谢！我的合作者就是用的你贴的3T3方法，但是他们没有弄出来。
我以前也用过3T3方法但是那个是野生型，很容易诱导的。
现在这个KO, 说不定就是如你所言和p53和Rb通路有间接关系，
我为了保险，想用其他方法来诱导，不知道除了用病毒，还有什么其他法子么？
比方说加个什么什么化学品之类的？
如果用病毒的话，是否要用lenti or retro vector?
【在 h******y 的大作中提到】
: 你说的比较温和是指什么？
: 来源于很多组织的人的fibroblast可以通过overexpress hTERT得到immortalization，
: 这是由于人的fibroblast在体外培养条件下的senescence多是由于端粒渐行缩短而导致
: 的（telomere-dependent replicative senescence）。与人的fibroblast不同，体外
: 培养中MEF的senescence并不是由于端粒缩短引起的,而是由于如前所述的过氧基团累积
: oxidative stress induced DNA damage。研究表明senescence的MEF的端粒还很长，而
: 且MEF中有较高的mTERT表达，所以过表达mTERT并不能有效immortalize MEF。因为要抑
: 制p53和Rb通路，所以表达异源的SV40 T和HPV16 E6/E7都可以immortalize MEF。当然
: 这样得到的细胞株，由于这些病毒蛋白的过量表达，基因组并不稳定，长久培养会出现
: 嬗变。
|
h******y
发帖数: 351 | 35 对于上皮细胞，最近有人发现利用feeder cells（主要是MEFs）和ROCK Inhibitor可以
有效immortalize。但是对于MEFs，光用ROCK Inhibitor可能不行。除了常用的SV40T和
HPV16 E6/E7，也可以用其他oncogene，例如c-Myc，Ras，BmiI，CDK4等等。因为MEFs
是原代细胞，转染效率很低，通常大家都用lenti，retro，或者电转。
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢！我的合作者就是用的你贴的3T3方法，但是他们没有弄出来。
: 我以前也用过3T3方法但是那个是野生型，很容易诱导的。
: 现在这个KO, 说不定就是如你所言和p53和Rb通路有间接关系，
: 我为了保险，想用其他方法来诱导，不知道除了用病毒，还有什么其他法子么？
: 比方说加个什么什么化学品之类的？
: 如果用病毒的话，是否要用lenti or retro vector?
|
s******y
发帖数: 28562 | 36 好的。谢谢！
我先去查查文献。如果还是不明白再来问你吧：）
MEFs
【在 h******y 的大作中提到】
: 对于上皮细胞，最近有人发现利用feeder cells（主要是MEFs）和ROCK Inhibitor可以
: 有效immortalize。但是对于MEFs，光用ROCK Inhibitor可能不行。除了常用的SV40T和
: HPV16 E6/E7，也可以用其他oncogene，例如c-Myc，Ras，BmiI，CDK4等等。因为MEFs
: 是原代细胞，转染效率很低，通常大家都用lenti，retro，或者电转。
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g****0
发帖数: 425 | 37 我都是把组织泡在Trypsin-0.53mM EDTA四度过夜，然后37度消化，一个embryo可以张3
-6盘10cm板，有何不妥吗？
【在 h******y 的大作中提到】
: 你这消化的时间太长了。
: 我的方法给你参考。
: E13.5或E14.5，去头去内脏，转到一个预先装有0.25%Trypsin-0.53mM EDTA的3mL注射
: 器里，从20G的针头中挤过。如果组织块太大的话，多挤几次。然后在37C消化5分钟。
: 用FBS终止酶消化，离心收集组织和细胞，用5mL pipette重悬。每1-2个胚胎可以铺一
: 个10cm的dish。一两天后就长满了，这算P0。需要注意的是所有和组织接触的塑料器皿
: 用前需要先润湿，否则组织很容易粘到上面。
: 传代用0.25%Trypsin-0.53mMEDTA，37C，3-5分钟。这算P1。从这里起，seeding
: density在4-5 X 10^3/cm2. 3-4天或者接近长满的时候分一次。一般在第2或3次的时候
: 冻足够多的细胞，1x10^6/vial. 运气好的话，一只孕鼠的6-8个胚胎分出来的MEF足够
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h******y
发帖数: 351 | 38 一个embyro出3-6个10cm的板？厉害，下次用你的办法试试。
张3
【在 g****0 的大作中提到】
: 我都是把组织泡在Trypsin-0.53mM EDTA四度过夜，然后37度消化，一个embryo可以张3
: -6盘10cm板，有何不妥吗？
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g****0
发帖数: 425 | 39 先切碎，再泡。都要冰凉的。过夜还有一个好处就是可以先拿到genotyping结果。
你试试，然后对比一下，看MEFcell有何不同。
【在 h******y 的大作中提到】
: 一个embyro出3-6个10cm的板？厉害，下次用你的办法试试。
:
: 张3
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y***y
发帖数: 709 | 40 搭车问个问题：
您用低氧培养的时候，MEF的生长速度和普通的CO2培养箱有很大差别？
我一般都是细胞长满了在1：5传代，在7-8代以前，感觉普通培养箱的细胞比低氧的长
快2倍不止。
可过了10代以后，普通培养箱的就慢下来了，低氧的好像却长得快起来。
before
【在 h******y 的大作中提到】
: If you culture MEF under 20% oxygen, then it is the best to use cells before
: passage 6 (please keep in mind that the best seeding density of MEF is
: about 5000/cm2.)
: If you culture the MEFs under 3-5% Oxygen, you can go up to 50 passages.
: Huge difference as you can see.
:
: 3-
: [发表自未名空间手机版 - m.mitbbs.com]
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y***y
发帖数: 709 | 41 这个太强大了！
比我的产量高出4-6倍。
张3
【在 g****0 的大作中提到】
: 我都是把组织泡在Trypsin-0.53mM EDTA四度过夜，然后37度消化，一个embryo可以张3
: -6盘10cm板，有何不妥吗？
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g*********5
发帖数: 2533 | 42 低氧的培养箱那里卖？
MEF
建立
【在 h******y 的大作中提到】
: MEF在20%氧气的培养条件下，很快（6-8个passage以后）就会停止生长。 这是因为MEF
: 对reactive oxygen species很敏感，由此引起的DNA damage激活p53以及其他信号（正
: 常生长因子和matrix缺失等）激活p16-Rb通路，引起senescence。你应该问一下他们给
: 你的MEF的passage，最好要到分离后第1或第2代的细胞，这样你还能用几代。
: 但是如果你把这些停止生长的细胞保留着（不要传代），过几个星期你会发现细胞又长
: 起来了，而且越长越好，这就是自发immortalized的细胞。很多MEF细胞系就是这样建立
: 起来的，例如著名的3T3系列。但是我不建议你用这些immortalized的MEF做实验，因为
: 上述ROS引起DNA damage的原因，这些自发immortalized的MEF已经产生太多基因变异（
: 因为需要bypass p53和p16-Rb两个重要通路的抑制），即使你看到表型的差异，也很难
: 说是你的gene KO的结果。
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h******y
发帖数: 351 | 43 Like this.
https://harlowscientific.com/incubators/thermo-heracell-240-co2-tri-gas-
incubator-used-demo-incubators
【在 g*********5 的大作中提到】
: 低氧的培养箱那里卖？
:
: MEF
: 建立
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h******y
发帖数: 351 | 44 MEF would grow faster in 3% O2 than in 20% O2. Maybe you can try different
seeding and subculture schedule?
【在 y***y 的大作中提到】
: 搭车问个问题：
: 您用低氧培养的时候，MEF的生长速度和普通的CO2培养箱有很大差别？
: 我一般都是细胞长满了在1：5传代，在7-8代以前，感觉普通培养箱的细胞比低氧的长
: 快2倍不止。
: 可过了10代以后，普通培养箱的就慢下来了，低氧的好像却长得快起来。
:
: before
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m*****z
发帖数: 1451 | 45 那几天长满呢？
张3
【在 g****0 的大作中提到】
: 我都是把组织泡在Trypsin-0.53mM EDTA四度过夜，然后37度消化，一个embryo可以张3
: -6盘10cm板，有何不妥吗？
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a******7
发帖数: 7936 | 46 是啊，培养液中为什么加b-ME啊，这玩意不是做western的时候用来保持蛋白完整性的
么？跟二硫键有关
【在 h******y 的大作中提到】
: 如果你的MEF是用作feeder的话，不建议用超过6代的细胞。
: MEF对ROS很敏感，传代过多，MEF会自发immortalization。
: 分MEF最简单的办法是把组织挤过18-20G的针头，然后trypsin 3-5 分钟。MEF的培养液
: 中不需要加b-ME.
:
: 了。
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t****t
发帖数: 86 | 47 Mark
【在 h******y 的大作中提到】
: 如果你的MEF是用作feeder的话，不建议用超过6代的细胞。
: MEF对ROS很敏感，传代过多，MEF会自发immortalization。
: 分MEF最简单的办法是把组织挤过18-20G的针头，然后trypsin 3-5 分钟。MEF的培养液
: 中不需要加b-ME.
:
: 了。
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g*********5
发帖数: 2533 | 48 thanks, how much about this?
【在 h******y 的大作中提到】
: Like this.
: https://harlowscientific.com/incubators/thermo-heracell-240-co2-tri-gas-
: incubator-used-demo-incubators
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h******y
发帖数: 351 | 49 I am not sure how much we paid for this model. You may need to get a quote
from the manufacturer or distributor.
【在 g*********5 的大作中提到】
: thanks, how much about this?
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