b*****n 发帖数: 1841 | 1 用Lenti Virus感染细胞,第一二代效果非常好,过表达的达到几百倍,Knock down的
达到90%的效率。但是传了三四代之后,过表达的只有几倍了,而knock down的几乎没
有看到效果。
Lenti virus同时携带GFP,可以看到传过几代之后,GFP还在,但是亮度大大下降。
以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
版上各位有否碰到类似的现象?如何解决? |
m*****z 发帖数: 1451 | 2 被silenced掉了
【在 b*****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用Lenti Virus感染细胞,第一二代效果非常好,过表达的达到几百倍,Knock down的 : 达到90%的效率。但是传了三四代之后,过表达的只有几倍了,而knock down的几乎没 : 有看到效果。 : Lenti virus同时携带GFP,可以看到传过几代之后,GFP还在,但是亮度大大下降。 : 以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。 : 版上各位有否碰到类似的现象?如何解决?
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t****t 发帖数: 86 | 3 碰到过
应该是蛋白过表达/敲降有毒
换细胞系/inducible system试试? |
b*****n 发帖数: 1841 | 4 选了三个完全不同的基因,都是同样的现象;而且细胞在感染当代,和control比,生
长和细胞形态没有看出有什么差别;尤其是knock down,预计不会对细胞有这么大的影
响。
感觉毒性不能够很好地解释。Inducible倒是可以试一下。
【在 t****t 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 碰到过 : 应该是蛋白过表达/敲降有毒 : 换细胞系/inducible system试试?
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h******y 发帖数: 351 | 5 有没有可能第一二代的时候,细胞内还有很多未整合的病毒DNA,这些extrachromosoma
l DNA也能作为模板转录出mRNA,引起高水平的表达(或抑制)。随着细胞分裂,这些未
整合的DNA逐渐丢失,仅剩下整合入染色体的几个copy制造mRNA,表现出来就是整体表达
水平下降。
【在 b*****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用Lenti Virus感染细胞,第一二代效果非常好,过表达的达到几百倍,Knock down的 : 达到90%的效率。但是传了三四代之后,过表达的只有几倍了,而knock down的几乎没 : 有看到效果。 : Lenti virus同时携带GFP,可以看到传过几代之后,GFP还在,但是亮度大大下降。 : 以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。 : 版上各位有否碰到类似的现象?如何解决?
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r***e 发帖数: 2539 | 6 这个基本没可能。
主要是高表达(多拷贝)的细胞没有选择优势。
extrachromosoma
些未
表达
【在 h******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有没有可能第一二代的时候,细胞内还有很多未整合的病毒DNA,这些extrachromosoma : l DNA也能作为模板转录出mRNA,引起高水平的表达(或抑制)。随着细胞分裂,这些未 : 整合的DNA逐渐丢失,仅剩下整合入染色体的几个copy制造mRNA,表现出来就是整体表达 : 水平下降。
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h******y 发帖数: 351 | 7 没有选择优势,为什么表达量下降的这么快呢?难道有选择劣势?
【在 r***e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个基本没可能。 : 主要是高表达(多拷贝)的细胞没有选择优势。 : : extrachromosoma : 些未 : 表达
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m*****z 发帖数: 1451 | 8 先做个quantitative PCR看看copy number有没有下降吧
有下降说明表达该基因可能有生长劣势
没变化就很有可能是被silenced掉了
lz转的什么细胞?
【在 b*****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 选了三个完全不同的基因,都是同样的现象;而且细胞在感染当代,和control比,生 : 长和细胞形态没有看出有什么差别;尤其是knock down,预计不会对细胞有这么大的影 : 响。 : 感觉毒性不能够很好地解释。Inducible倒是可以试一下。
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s******s 发帖数: 13035 | 9 啥promoter啊?
报导说cmv在es里面被silence, 我的经验是就算不在es里面,cmv也经常
被干掉了。
【在 b*****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用Lenti Virus感染细胞,第一二代效果非常好,过表达的达到几百倍,Knock down的 : 达到90%的效率。但是传了三四代之后,过表达的只有几倍了,而knock down的几乎没 : 有看到效果。 : Lenti virus同时携带GFP,可以看到传过几代之后,GFP还在,但是亮度大大下降。 : 以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。 : 版上各位有否碰到类似的现象?如何解决?
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b*****n 发帖数: 1841 | 10 就是CMV promoter
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 啥promoter啊? : 报导说cmv在es里面被silence, 我的经验是就算不在es里面,cmv也经常 : 被干掉了。
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b*****n 发帖数: 1841 | 11 为什么没有可能?详解?我自己想到的就是virus不整合。
【在 r***e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个基本没可能。 : 主要是高表达(多拷贝)的细胞没有选择优势。 : : extrachromosoma : 些未 : 表达
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s******s 发帖数: 13035 | 12 换pgk吧。cmv这玩意儿虽然比较强,但是问题多多
【在 b*****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 就是CMV promoter
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b*****n 发帖数: 1841 | 13 这个可以一试。
【在 m*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 先做个quantitative PCR看看copy number有没有下降吧 : 有下降说明表达该基因可能有生长劣势 : 没变化就很有可能是被silenced掉了 : lz转的什么细胞?
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b*****n 发帖数: 1841 | 14 RNAi的construct是公司直接买的,做subcloning的话要费神了。
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 换pgk吧。cmv这玩意儿虽然比较强,但是问题多多
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r***e 发帖数: 2539 | 15 除非你用的是特殊的integrate deficient的病毒,否则整合没什么问题。基本上就是转
进去的基因或shRNA对生长不利。最好报一下是什么细胞?
另外cmv没这么容易silence,除了es cell之类的。pgk表达量非常低。另外一种极端的
情况是,cmv受NFkB影响,如果你的基因能抑制NFkB。
【在 b*****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 为什么没有可能?详解?我自己想到的就是virus不整合。
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X******n 发帖数: 914 | |
r***e 发帖数: 2539 | 17 这个建议可以试试。
挑了单克隆你会发现,GFP表达少的细胞长的好。表达很高的很难活下来,所以另外一种
原因是GFP毒性。
【在 X******n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果挑几个单克隆会不会好点呢?
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a*******a 发帖数: 4233 | 18 一般我用lenti都不做stable line,除非有生长优势,否则很容易丢掉。 |
h********n 发帖数: 4079 | 19 promoter被silence的情况要看细胞/组织类型.
可以试试不同的promoter, 有些比较强的mammalian promoter可能从长远来看更好.
不过我用CMV效果挺好的, 所以要看具体细胞类型. |
s******s 发帖数: 13035 | 20 我说了,自己试验经验,除了es,有几个细胞系cmv也不行,当然也有
好用的时候,否则这个promoter也不会popular.
pgk一点也不低,算是中高的promoter,虽然比不上cmv,但是比大多数其他的强多了
是转
【在 r***e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 除非你用的是特殊的integrate deficient的病毒,否则整合没什么问题。基本上就是转 : 进去的基因或shRNA对生长不利。最好报一下是什么细胞? : 另外cmv没这么容易silence,除了es cell之类的。pgk表达量非常低。另外一种极端的 : 情况是,cmv受NFkB影响,如果你的基因能抑制NFkB。
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w***a 发帖数: 432 | 21 gfp 未必和基因同一个启动子。
【在 b*****n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用Lenti Virus感染细胞,第一二代效果非常好,过表达的达到几百倍,Knock down的 : 达到90%的效率。但是传了三四代之后,过表达的只有几倍了,而knock down的几乎没 : 有看到效果。 : Lenti virus同时携带GFP,可以看到传过几代之后,GFP还在,但是亮度大大下降。 : 以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。 : 版上各位有否碰到类似的现象?如何解决?
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s******y 发帖数: 28562 | 22 如果是IRES的话,也经常有不表达下游基因的情况发生
【在 w***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : gfp 未必和基因同一个启动子。
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q******g 发帖数: 3858 | 23 我一般sorting之后,就冻起来一批。培养3-4代后,就换新的。 |
r***e 发帖数: 2539 | 24 我用的不多,但是自己经验是pgk比cmv弱很多(只有10-20%)。
你说的大多数有哪些?我想了解一下,当然说的是通用promoter,不是tissue-specifi
c promoter。
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我说了,自己试验经验,除了es,有几个细胞系cmv也不行,当然也有 : 好用的时候,否则这个promoter也不会popular. : pgk一点也不低,算是中高的promoter,虽然比不上cmv,但是比大多数其他的强多了 : : 是转
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