b*****n
发帖数: 1841 | 1 用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
有看到效果。
Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？ |
m*****z
发帖数: 1451 | 2 被silenced掉了
【在 b*****n 的大作中提到】
: 用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
: 达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
: 有看到效果。
: Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
: 以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
: 版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？
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t****t
发帖数: 86 | 3 碰到过
应该是蛋白过表达/敲降有毒
换细胞系/inducible system试试? |
b*****n
发帖数: 1841 | 4 选了三个完全不同的基因，都是同样的现象；而且细胞在感染当代，和control比，生
长和细胞形态没有看出有什么差别；尤其是knock down，预计不会对细胞有这么大的影
响。
感觉毒性不能够很好地解释。Inducible倒是可以试一下。
【在 t****t 的大作中提到】
: 碰到过
: 应该是蛋白过表达/敲降有毒
: 换细胞系/inducible system试试?
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h******y
发帖数: 351 | 5 有没有可能第一二代的时候，细胞内还有很多未整合的病毒DNA，这些extrachromosoma
l DNA也能作为模板转录出mRNA，引起高水平的表达（或抑制）。随着细胞分裂，这些未
整合的DNA逐渐丢失，仅剩下整合入染色体的几个copy制造mRNA，表现出来就是整体表达
水平下降。
【在 b*****n 的大作中提到】
: 用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
: 达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
: 有看到效果。
: Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
: 以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
: 版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？
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r***e
发帖数: 2539 | 6 这个基本没可能。
主要是高表达（多拷贝）的细胞没有选择优势。
extrachromosoma
些未
表达
【在 h******y 的大作中提到】
: 有没有可能第一二代的时候，细胞内还有很多未整合的病毒DNA，这些extrachromosoma
: l DNA也能作为模板转录出mRNA，引起高水平的表达（或抑制）。随着细胞分裂，这些未
: 整合的DNA逐渐丢失，仅剩下整合入染色体的几个copy制造mRNA，表现出来就是整体表达
: 水平下降。
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h******y
发帖数: 351 | 7 没有选择优势，为什么表达量下降的这么快呢？难道有选择劣势？
【在 r***e 的大作中提到】
: 这个基本没可能。
: 主要是高表达（多拷贝）的细胞没有选择优势。
:
: extrachromosoma
: 些未
: 表达
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m*****z
发帖数: 1451 | 8 先做个quantitative PCR看看copy number有没有下降吧
有下降说明表达该基因可能有生长劣势
没变化就很有可能是被silenced掉了
lz转的什么细胞？
【在 b*****n 的大作中提到】
: 选了三个完全不同的基因，都是同样的现象；而且细胞在感染当代，和control比，生
: 长和细胞形态没有看出有什么差别；尤其是knock down，预计不会对细胞有这么大的影
: 响。
: 感觉毒性不能够很好地解释。Inducible倒是可以试一下。
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s******s
发帖数: 13035 | 9 啥promoter啊？
报导说cmv在es里面被silence, 我的经验是就算不在es里面，cmv也经常
被干掉了。
【在 b*****n 的大作中提到】
: 用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
: 达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
: 有看到效果。
: Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
: 以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
: 版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？
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b*****n
发帖数: 1841 | 10 就是CMV promoter
【在 s******s 的大作中提到】
: 啥promoter啊？
: 报导说cmv在es里面被silence, 我的经验是就算不在es里面，cmv也经常
: 被干掉了。
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b*****n
发帖数: 1841 | 11 为什么没有可能？详解？我自己想到的就是virus不整合。
【在 r***e 的大作中提到】
: 这个基本没可能。
: 主要是高表达（多拷贝）的细胞没有选择优势。
:
: extrachromosoma
: 些未
: 表达
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s******s
发帖数: 13035 | 12 换pgk吧。cmv这玩意儿虽然比较强，但是问题多多
【在 b*****n 的大作中提到】
: 就是CMV promoter
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b*****n
发帖数: 1841 | 13 这个可以一试。
【在 m*****z 的大作中提到】
: 先做个quantitative PCR看看copy number有没有下降吧
: 有下降说明表达该基因可能有生长劣势
: 没变化就很有可能是被silenced掉了
: lz转的什么细胞？
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b*****n
发帖数: 1841 | 14 RNAi的construct是公司直接买的，做subcloning的话要费神了。
【在 s******s 的大作中提到】
: 换pgk吧。cmv这玩意儿虽然比较强，但是问题多多
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r***e
发帖数: 2539 | 15 除非你用的是特殊的integrate deficient的病毒，否则整合没什么问题。基本上就是转
进去的基因或shRNA对生长不利。最好报一下是什么细胞？
另外cmv没这么容易silence，除了es cell之类的。pgk表达量非常低。另外一种极端的
情况是，cmv受NFkB影响，如果你的基因能抑制NFkB。
【在 b*****n 的大作中提到】
: 为什么没有可能？详解？我自己想到的就是virus不整合。
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X******n
发帖数: 914 | |
r***e
发帖数: 2539 | 17 这个建议可以试试。
挑了单克隆你会发现，GFP表达少的细胞长的好。表达很高的很难活下来，所以另外一种
原因是GFP毒性。
【在 X******n 的大作中提到】
: 如果挑几个单克隆会不会好点呢？
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a*******a
发帖数: 4233 | 18 一般我用lenti都不做stable line，除非有生长优势，否则很容易丢掉。 |
h********n
发帖数: 4079 | 19 promoter被silence的情况要看细胞/组织类型.
可以试试不同的promoter, 有些比较强的mammalian promoter可能从长远来看更好.
不过我用CMV效果挺好的, 所以要看具体细胞类型. |
s******s
发帖数: 13035 | 20 我说了，自己试验经验，除了es，有几个细胞系cmv也不行，当然也有
好用的时候，否则这个promoter也不会popular.
pgk一点也不低，算是中高的promoter，虽然比不上cmv，但是比大多数其他的强多了
是转
【在 r***e 的大作中提到】
: 除非你用的是特殊的integrate deficient的病毒，否则整合没什么问题。基本上就是转
: 进去的基因或shRNA对生长不利。最好报一下是什么细胞？
: 另外cmv没这么容易silence，除了es cell之类的。pgk表达量非常低。另外一种极端的
: 情况是，cmv受NFkB影响，如果你的基因能抑制NFkB。
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w***a
发帖数: 432 | 21 gfp 未必和基因同一个启动子。
【在 b*****n 的大作中提到】
: 用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
: 达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
: 有看到效果。
: Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
: 以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
: 版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？
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s******y
发帖数: 28562 | 22 如果是IRES的话，也经常有不表达下游基因的情况发生
【在 w***a 的大作中提到】
: gfp 未必和基因同一个启动子。
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q******g
发帖数: 3858 | 23 我一般sorting之后，就冻起来一批。培养3-4代后，就换新的。 |
r***e
发帖数: 2539 | 24 我用的不多，但是自己经验是pgk比cmv弱很多（只有10-20%）。
你说的大多数有哪些？我想了解一下，当然说的是通用promoter，不是tissue-specifi
c promoter。
【在 s******s 的大作中提到】
: 我说了，自己试验经验，除了es，有几个细胞系cmv也不行，当然也有
: 好用的时候，否则这个promoter也不会popular.
: pgk一点也不低，算是中高的promoter，虽然比不上cmv，但是比大多数其他的强多了
:
: 是转
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