a*****x
发帖数: 901 | 1 Gs alpha。有什么检测方法？集思广益一下。多谢各位大牛。 |
a*****x
发帖数: 901 | |
s****9
发帖数: 932 | 3 Gs is limited. You overexpressed another well-known Gs-coupled protein to
see whether it can interfere your gene expression.
【在 a*****x 的大作中提到】
: Gs alpha。有什么检测方法？集思广益一下。多谢各位大牛。
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a*****x
发帖数: 901 | 4 这是个方法，值得考虑。但是很多细胞系over-express GPCR还是很困难的。而且即使
不成功也不能完全排除Gs alpha的可能，因为也许还有其他必要signaling molecule被
over-express 这个GPCR disrupt了。
有没有更好的方法，最好能provide smoking gun这种。我自己有些想法，但是还是希
望集思广益一下。
【在 s****9 的大作中提到】
: Gs is limited. You overexpressed another well-known Gs-coupled protein to
: see whether it can interfere your gene expression.
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s******y
发帖数: 28562 | 5 哇靠，这个问题超过了我的专业范围，我只能大概就我知道的其他文章的例子
来建议一下吧。
要检测是否通过G protein, 无非就是这么几个思路：
1. G-protein specific inhibition: non-hydrolyzable GTP analog, GEF analog,
Knockdown of G-protein.
2. G protein dominant negative mutant
3. G protein dominant positive mutant
4. Or if you know something is in the middle of a pathway, you can also cut
off that middle player with methods similar as above.
【在 a*****x 的大作中提到】
: Gs alpha。有什么检测方法？集思广益一下。多谢各位大牛。
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a*****x
发帖数: 901 | 6 多谢！G protein dominant positive mutant没有听说过，是哪个reference？
non-hydrolyzable GTP analog和GDP analog我以前常用。但是它们不能穿过细胞膜，
所以用在看基因表达的实验有点困难。 |
s******y
发帖数: 28562 | 7 dominant positive mutant需要做screening 的，除非你有这个资源，不然不要
自己做。一般就是直接查文献看看你关心的那个蛋白有没有人做过。
大体思路就是，其实GTP什么的就是用电荷来改变蛋白结构嘛，所以干脆把相关
binding pocket 的氨基酸给突变加上负电荷，有时候是可以产生dominant positive
【在 a*****x 的大作中提到】
: 多谢！G protein dominant positive mutant没有听说过，是哪个reference？
: non-hydrolyzable GTP analog和GDP analog我以前常用。但是它们不能穿过细胞膜，
: 所以用在看基因表达的实验有点困难。
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s******y
发帖数: 28562 | 8 另外，non-hydrolyzable GTP analog和GDP analog，你难道不能用脂类包埋的
方式来辅助过膜么？要确认是否成功过膜也比较简单，同时放点可溶的荧光分子
就好了。
【在 a*****x 的大作中提到】
: 多谢！G protein dominant positive mutant没有听说过，是哪个reference？
: non-hydrolyzable GTP analog和GDP analog我以前常用。但是它们不能穿过细胞膜，
: 所以用在看基因表达的实验有点困难。
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m***i
发帖数: 4637 | 9 PI3P/2P level ?
【在 a*****x 的大作中提到】
: Gs alpha。有什么检测方法？集思广益一下。多谢各位大牛。
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a*****x
发帖数: 901 | 10 试过，不work。文章里有先permeablize cell的，但觉得动作太大了，会引起很多
artifact，尤其我们要看的readout还很慢。
【在 s******y 的大作中提到】
: 另外，non-hydrolyzable GTP analog和GDP analog，你难道不能用脂类包埋的
: 方式来辅助过膜么？要确认是否成功过膜也比较简单，同时放点可溶的荧光分子
: 就好了。
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s******y
发帖数: 28562 | 11 那就比较麻烦了。
先看看有没有人做过你们用的Ga的突变体吧。
另外，要证明是否artifact 还是可以的，关键是要做好control experiments,
比方说用普通的GTP 进行对照。我也知道有人用microinjection 的方法来做的，
但是这个方法一样是artifact非常严重，关键是要作好对照。
【在 a*****x 的大作中提到】
: 试过，不work。文章里有先permeablize cell的，但觉得动作太大了，会引起很多
: artifact，尤其我们要看的readout还很慢。
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a*****x
发帖数: 901 | 12 我们以前就是inject的，但是readout很快，而且是单细胞readout,作了很多control。
用permeablized的方法主要担心细胞活不了这么久。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 那就比较麻烦了。
: 先看看有没有人做过你们用的Ga的突变体吧。
: 另外，要证明是否artifact 还是可以的，关键是要做好control experiments,
: 比方说用普通的GTP 进行对照。我也知道有人用microinjection 的方法来做的，
: 但是这个方法一样是artifact非常严重，关键是要作好对照。
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s******y
发帖数: 28562 | 13 在我听来的印象中，permeablize 的方法并不比injection harsh 多少。
【在 a*****x 的大作中提到】
: 我们以前就是inject的，但是readout很快，而且是单细胞readout,作了很多control。
: 用permeablized的方法主要担心细胞活不了这么久。。。
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a*****x
发帖数: 901 | 14 也许。但是之前是inject后几分钟就可以看到变化或者做测试，这里要几十个小时。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 在我听来的印象中，permeablize 的方法并不比injection harsh 多少。
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p*****e
发帖数: 93 | 15 two isoforms for Gas; short one, GasQ213L; long one, GasQ227L. these are
constitutive active mutants. Dominant negative mutants, GasQ213L/D281N and
GasQ227L/D295N. you can buy from www.cDNA.org
【在 a*****x 的大作中提到】
: Gs alpha。有什么检测方法？集思广益一下。多谢各位大牛。
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p*****e
发帖数: 93 | 16 but, I personally think the knockdown is the best way. |
l**********1
发帖数: 5204 | 17 it might take 3 Ys or even more conditional GPCRs (--) (+-) (++)
Mouse/Rat/zebrafish
LZ her/his CEO/CFO can not allow him to do that
so that kind of task always likes below:
同主题阅读：现在的核心问题是没有什么上手快，费少，钱又多，又稳定，又体面，又
不是青春饭的protocol/method/patent
[版面:生物学][首篇作者：KeeVan] , 2012年09月25日
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31733655.html
【在 p*****e 的大作中提到】
: but, I personally think the knockdown is the best way.
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s******y
发帖数: 28562 | 18 他建议的是knockdown 不是knockout :)
【在 l**********1 的大作中提到】
: it might take 3 Ys or even more conditional GPCRs (--) (+-) (++)
: Mouse/Rat/zebrafish
: LZ her/his CEO/CFO can not allow him to do that
: so that kind of task always likes below:
: 同主题阅读：现在的核心问题是没有什么上手快，费少，钱又多，又稳定，又体面，又
: 不是青春饭的protocol/method/patent
: [版面:生物学][首篇作者：KeeVan] , 2012年09月25日
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31733655.html
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s******y
发帖数: 28562 | 19 狂赞，还是内行人的意见比较靠谱。
and
【在 p*****e 的大作中提到】
: two isoforms for Gas; short one, GasQ213L; long one, GasQ227L. these are
: constitutive active mutants. Dominant negative mutants, GasQ213L/D281N and
: GasQ227L/D295N. you can buy from www.cDNA.org
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a*****x
发帖数: 901 | 20 多谢多谢。给你发包子
and
【在 p*****e 的大作中提到】
: two isoforms for Gas; short one, GasQ213L; long one, GasQ227L. these are
: constitutive active mutants. Dominant negative mutants, GasQ213L/D281N and
: GasQ227L/D295N. you can buy from www.cDNA.org
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l**********1
发帖数: 5204 | 21 看错啦 matrix
作为将功补过
LZ
pls refer
Castellone MD et al. (2005)
title:
Prostaglandin E2 Promotes Colon Cancer Cell Growth Through a
Gs-Axin-b-Catenin Signaling Axis
Science. 310: 1504-10.
its Fig. 2B
PubMed link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16293724
【在 s******y 的大作中提到】
: 他建议的是knockdown 不是knockout :)
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M*****e
发帖数: 279 | 22 Try toxins, such as PTX, CTX |
l**********1
发帖数: 5204 | 23 Sure
plus
Ku GM et al. (2012)
An siRNA screen in pancreatic beta cells reveals a role for Gpr27 in insulin
production.
PLoS Genet. 8: e1002449.
Abstract
ignored
We show that knockdown of Gpr27 reduces endogenous mouse insulin promoter
activity and glucose stimulated insulin secretion. Furthermore, we show that
Pdx1 is important for Gpr27's effect on the insulin promoter and insulin
secretion. Finally, the over-expression of Gpr27 in 293T cells increases
inositol phosphate levels, while knockdown of Gpr27 in MIN6 cells reduces
inositol phosphate levels, suggesting this orphan GPCR might couple to Gq/11
. In summary, we demonstrate a MIN6-based siRNA screening system that allows
rapid identification of novel positive and negative regulators of the
insulin promoter. Using this system, we identify Gpr27 as a positive
regulator of insulin production.
web link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22253604
【在 s******y 的大作中提到】
: 他建议的是knockdown 不是knockout :)
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