a******1
发帖数: 116 | 1 最近正在搞这个，
把actin, GSH, H2O2混一块儿，跑western, anti-actin, 结果除了actin自身的条带还
有一个分子量小一些的条带；
只把actin和GSH混一块儿就只有一条正常的带；
一直没想出个合理的解释，请问版上的大家有何高见哇～
多谢 | S*********s
发帖数: 304 | 2 既然你做这么specific的实验，想必你在做protein S-glutathiolation的研究
可能的解释就是
GSH+GSH（+H2O2）->GSSG
Actin+GSSG->Actin-SSH
但有两个问题
1）你跑了Western,正常情况应该加了DTT,不应该看到modified actin
加DTT多煮煮，看看是否还在
另外，可以coincubate with IAA or IAM,do IEF，you should get more information
2) 一般来说band should go upshift, 但你看到了downshift,所以不敢肯定
这种情况时有发生
If it is really S-glutathiolation, you should go in vivo.
1)Check whether this modification happens under physiological and
pathological or drug treatment conditions.
2)Whether it is functional
Good luck.
【在 a******1 的大作中提到】
: 最近正在搞这个，
: 把actin, GSH, H2O2混一块儿，跑western, anti-actin, 结果除了actin自身的条带还
: 有一个分子量小一些的条带；
: 只把actin和GSH混一块儿就只有一条正常的带；
: 一直没想出个合理的解释，请问版上的大家有何高见哇～
: 多谢
| S*********s
发帖数: 304 | 3 make sure you are using recombinant protein not cell lysate.
Otherwise it is too complicate
【在 a******1 的大作中提到】
: 最近正在搞这个，
: 把actin, GSH, H2O2混一块儿，跑western, anti-actin, 结果除了actin自身的条带还
: 有一个分子量小一些的条带；
: 只把actin和GSH混一块儿就只有一条正常的带；
: 一直没想出个合理的解释，请问版上的大家有何高见哇～
: 多谢
| a******1
发帖数: 116 | 4 最近正在搞这个，
把actin, GSH, H2O2混一块儿，跑western, anti-actin, 结果除了actin自身的条带还
有一个分子量小一些的条带；
只把actin和GSH混一块儿就只有一条正常的带；
一直没想出个合理的解释，请问版上的大家有何高见哇～
多谢 | S*********s
发帖数: 304 | 5 既然你做这么specific的实验，想必你在做protein S-glutathiolation的研究
可能的解释就是
GSH+GSH（+H2O2）->GSSG
Actin+GSSG->Actin-SSH
但有两个问题
1）你跑了Western,正常情况应该加了DTT,不应该看到modified actin
加DTT多煮煮，看看是否还在
另外，可以coincubate with IAA or IAM,do IEF，you should get more information
2) 一般来说band should go upshift, 但你看到了downshift,所以不敢肯定
这种情况时有发生
If it is really S-glutathiolation, you should go in vivo.
1)Check whether this modification happens under physiological and
pathological or drug treatment conditions.
2)Whether it is functional
Good luck.
【在 a******1 的大作中提到】
: 最近正在搞这个，
: 把actin, GSH, H2O2混一块儿，跑western, anti-actin, 结果除了actin自身的条带还
: 有一个分子量小一些的条带；
: 只把actin和GSH混一块儿就只有一条正常的带；
: 一直没想出个合理的解释，请问版上的大家有何高见哇～
: 多谢
| S*********s
发帖数: 304 | 6 make sure you are using recombinant protein not cell lysate.
Otherwise it is too complicate
【在 a******1 的大作中提到】
: 最近正在搞这个，
: 把actin, GSH, H2O2混一块儿，跑western, anti-actin, 结果除了actin自身的条带还
: 有一个分子量小一些的条带；
: 只把actin和GSH混一块儿就只有一条正常的带；
: 一直没想出个合理的解释，请问版上的大家有何高见哇～
: 多谢
| s******y
发帖数: 28562 | 7 Summerwinds说的有道理，但是鉴于那个band size 变小，我再补充一个可能性，
就是actin oxidized。这种情况下是可能会跑得更快的（因为构型变了）
information
【在 S*********s 的大作中提到】
: 既然你做这么specific的实验，想必你在做protein S-glutathiolation的研究
: 可能的解释就是
: GSH+GSH（+H2O2）->GSSG
: Actin+GSSG->Actin-SSH
: 但有两个问题
: 1）你跑了Western,正常情况应该加了DTT,不应该看到modified actin
: 加DTT多煮煮，看看是否还在
: 另外，可以coincubate with IAA or IAM,do IEF，you should get more information
: 2) 一般来说band should go upshift, 但你看到了downshift,所以不敢肯定
: 这种情况时有发生
| a******1
发帖数: 116 | 8 是啊，刚开始做这个，好多都不懂，
我的loading buffer里加了b-ＭＥ，92C煮了8分钟; 其中有dtt的sample的确分子量小
的那条band变少了。
贴了个western图：左边是actin(1ug)+gsh(500uM)+h2o2(500uM) 在25ul反应体系，上
样量是1/2, 右边是在此基础上再加了10mM DTT的western 结果 ，anti-actin, 从上
至下第一条band是actin的大小（42kD）,小的大概27，28kD
如果是upshift就好明白多了哇，这是第二次出现这种情况
IEF没怎么接触过，先做点homework去.
多谢
information
【在 S*********s 的大作中提到】
: 既然你做这么specific的实验，想必你在做protein S-glutathiolation的研究
: 可能的解释就是
: GSH+GSH（+H2O2）->GSSG
: Actin+GSSG->Actin-SSH
: 但有两个问题
: 1）你跑了Western,正常情况应该加了DTT,不应该看到modified actin
: 加DTT多煮煮，看看是否还在
: 另外，可以coincubate with IAA or IAM,do IEF，you should get more information
: 2) 一般来说band should go upshift, 但你看到了downshift,所以不敢肯定
: 这种情况时有发生
| a******1
发帖数: 116 | 9 actin 是从Cytoskeleton买的
【在 S*********s 的大作中提到】
: make sure you are using recombinant protein not cell lysate.
: Otherwise it is too complicate
| a******1
发帖数: 116 | 10 in vivo 的actin s-glutathionylation 不是早被证实了的么，以前也用cell lysate
做过了
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【在 S*********s 的大作中提到】
: 既然你做这么specific的实验，想必你在做protein S-glutathiolation的研究
: 可能的解释就是
: GSH+GSH（+H2O2）->GSSG
: Actin+GSSG->Actin-SSH
: 但有两个问题
: 1）你跑了Western,正常情况应该加了DTT,不应该看到modified actin
: 加DTT多煮煮，看看是否还在
: 另外，可以coincubate with IAA or IAM,do IEF，you should get more information
: 2) 一般来说band should go upshift, 但你看到了downshift,所以不敢肯定
: 这种情况时有发生
| S*********s
发帖数: 304 | 11 还有sunnyday说的这种可能性。
可以直接用买GSSG，sigma就有，in vitro incubate,可以exclue or confirm this
possibility.
另外，你的western band强度不一样啊，in vitro做assay,应当非常一致才对。
【在 s******y 的大作中提到】
: Summerwinds说的有道理，但是鉴于那个band size 变小，我再补充一个可能性，
: 就是actin oxidized。这种情况下是可能会跑得更快的（因为构型变了）
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: information
| a******1
发帖数: 116 | 12
【在 S*********s 的大作中提到】
: 还有sunnyday说的这种可能性。
: 可以直接用买GSSG，sigma就有，in vitro incubate,可以exclue or confirm this
: possibility.
: 另外，你的western band强度不一样啊，in vitro做assay,应当非常一致才对。
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