t******y
发帖数: 716 | 1 请问谁碰到过类似的情况？
一个转基因老鼠，目标基因A的exon 1被lacZ基因取代。但是从突变体纯合子分离到的
原代细胞里还是能够检测到目标蛋白A的表达。用qPCR检测目标其mRNA水平虽然要比野
生型少很多，但是也能够检测得到（大概是野生型的百分之五左右）。exon1包括翻译
起始位点ATG以及后面大概250个碱基。此突变体纯合子表型明显，杂合子没有表型。 |
b******n
发帖数: 4225 | 2 你突变体纯合子能被抗体检测，是western还是免疫组化？
突变体纯合子的mRNA可以做primer extension，看看是不是有alternative start
codon
想降低qPCR本底水平，引物可以设计一端priming在exon1，另外一端在别的exon或者5'
-UTR
【在 t******y 的大作中提到】
: 请问谁碰到过类似的情况？
: 一个转基因老鼠，目标基因A的exon 1被lacZ基因取代。但是从突变体纯合子分离到的
: 原代细胞里还是能够检测到目标蛋白A的表达。用qPCR检测目标其mRNA水平虽然要比野
: 生型少很多，但是也能够检测得到（大概是野生型的百分之五左右）。exon1包括翻译
: 起始位点ATG以及后面大概250个碱基。此突变体纯合子表型明显，杂合子没有表型。
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t******y
发帖数: 716 | 3 western 检测得到，但是蛋白量没有野生型多。 |
c****l
发帖数: 1086 | 4 这不是很正常吗，你的ko可能是in frame 的exon 1 replacement，蛋白的其他domain
还在， 如果你的抗体是polyclonal或是别exon1以外的epitope，当然可以监测到了 |
t******y
发帖数: 716 | 5 插入的lacz后面有一个stop codon，而且exon 1 里面包括进入内质网表达的信号肽，
这样还会表达蛋白的其他domain吗？
domain
【在 c****l 的大作中提到】
: 这不是很正常吗，你的ko可能是in frame 的exon 1 replacement，蛋白的其他domain
: 还在， 如果你的抗体是polyclonal或是别exon1以外的epitope，当然可以监测到了
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f**u
发帖数: 346 | 6 看看有没有可能是splicing把你的lacZ给跳过去了
【在 t******y 的大作中提到】
: 插入的lacz后面有一个stop codon，而且exon 1 里面包括进入内质网表达的信号肽，
: 这样还会表达蛋白的其他domain吗？
:
: domain
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b*****o
发帖数: 150 | 7 就是这个道理，这是很正常的。有时候做KO的人没有考虑到去掉EXON后前面和后门的
EXONS还能连在一起。就是碱基数是３的倍数（IN FRAME）。如果是这样的话，有些功
能蛋白去掉一些片段仍然有功能，尽管功能会降低。如果要KO的蛋白功能研究的非常清
楚，这时就要敲除关键的蛋白片段对应的EXON。
domain
【在 c****l 的大作中提到】
: 这不是很正常吗，你的ko可能是in frame 的exon 1 replacement，蛋白的其他domain
: 还在， 如果你的抗体是polyclonal或是别exon1以外的epitope，当然可以监测到了
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b*****o
发帖数: 150 | 8 E coli的Stop codon的使用频率和真核生物的使用频率是不一样的。如果使用了老鼠不
常用的stop codon，那就很有可能"通读"了。
建议你在KO EXON的上游和下游各设计一对QPCR引物，然后检测就能知道你的STOP
CODON是否起作用。
【在 t******y 的大作中提到】
: 插入的lacz后面有一个stop codon，而且exon 1 里面包括进入内质网表达的信号肽，
: 这样还会表达蛋白的其他domain吗？
:
: domain
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