m*******8
发帖数: 256 | 1 最近用昆虫细胞分泌表达了两个蛋白的复合物，his tag纯化以后用Amicon浓缩体积到
300ul左右上Superdex 200柱子，结果只有很低的峰。跑了PAGE胶，gel filtration之
前取了1/150体积的样，蛋白量很多，过柱子后的fraction取了1/20的样，基本看不到
条带。把所有的fraction收集起来再用Amicon浓缩，也没蛋白，不知道蛋白哪里去了？
过柱子时奇怪的是基线一开始就从0 mAU跳到30 mAU，目的蛋白处的峰只有45mAU,在一
个柱体积快结束的时候突然出现很多500mAU左右的峰，不知道是什么东西。辛辛苦苦搞
了这么多蛋白全没了，很沮丧，关键是不知道哪里出错了，哪位大侠能指点迷津，不胜
感激！ |
b******n
发帖数: 4225 | 2 不是专家，是不是你的蛋白在gel filtration的时候aggregate了？
500mAU的峰也许是你的蛋白？收集下来跑个SDS-PAGE吧
【在 m*******8 的大作中提到】
: 最近用昆虫细胞分泌表达了两个蛋白的复合物，his tag纯化以后用Amicon浓缩体积到
: 300ul左右上Superdex 200柱子，结果只有很低的峰。跑了PAGE胶，gel filtration之
: 前取了1/150体积的样，蛋白量很多，过柱子后的fraction取了1/20的样，基本看不到
: 条带。把所有的fraction收集起来再用Amicon浓缩，也没蛋白，不知道蛋白哪里去了？
: 过柱子时奇怪的是基线一开始就从0 mAU跳到30 mAU，目的蛋白处的峰只有45mAU,在一
: 个柱体积快结束的时候突然出现很多500mAU左右的峰，不知道是什么东西。辛辛苦苦搞
: 了这么多蛋白全没了，很沮丧，关键是不知道哪里出错了，哪位大侠能指点迷津，不胜
: 感激！
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a****k
发帖数: 1130 | 3 load到gel filtration之前有没有过filter？有可能是bind在filter上了
【在 m*******8 的大作中提到】
: 最近用昆虫细胞分泌表达了两个蛋白的复合物，his tag纯化以后用Amicon浓缩体积到
: 300ul左右上Superdex 200柱子，结果只有很低的峰。跑了PAGE胶，gel filtration之
: 前取了1/150体积的样，蛋白量很多，过柱子后的fraction取了1/20的样，基本看不到
: 条带。把所有的fraction收集起来再用Amicon浓缩，也没蛋白，不知道蛋白哪里去了？
: 过柱子时奇怪的是基线一开始就从0 mAU跳到30 mAU，目的蛋白处的峰只有45mAU,在一
: 个柱体积快结束的时候突然出现很多500mAU左右的峰，不知道是什么东西。辛辛苦苦搞
: 了这么多蛋白全没了，很沮丧，关键是不知道哪里出错了，哪位大侠能指点迷津，不胜
: 感激！
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m*******8
发帖数: 256 | 4 多谢回复！我把所有的fractions汇集重新浓缩了，没有蛋白。Load柱子之前没有过滤
。现在也怀疑是不是aggregate了，但是想不明白为何会aggregate，gel filtration的
buffer和his purification的一样，就是不含imidazole。还有就是蛋白在柱子里
aggregate后都跑哪里去了，洗脱不下来吗。 |
b******n
发帖数: 4225 | 5 蛋白在eluted fraction里面没了就只可能留在柱子里或者flow through了
除非你提纯了高浓度蛋白酶，自我降解了
aggregate之后size发生了变化了
没有imidazole，离子强度发生了很大变化，毕竟imidazole浓度都不低
【在 m*******8 的大作中提到】
: 多谢回复！我把所有的fractions汇集重新浓缩了，没有蛋白。Load柱子之前没有过滤
: 。现在也怀疑是不是aggregate了，但是想不明白为何会aggregate，gel filtration的
: buffer和his purification的一样，就是不含imidazole。还有就是蛋白在柱子里
: aggregate后都跑哪里去了，洗脱不下来吗。
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a****k
发帖数: 1130 | 6 这倒是挺奇怪的，我以前见到这种现象是因为有些牌子的filter会binding蛋白，其实
想到于最终都没有load到柱子上
你那个1CV处出来的峰不会是蛋白，应该是imidazole和salt
aggregate会最先出来，你void volume里的峰怎么样？
【在 m*******8 的大作中提到】
: 多谢回复！我把所有的fractions汇集重新浓缩了，没有蛋白。Load柱子之前没有过滤
: 。现在也怀疑是不是aggregate了，但是想不明白为何会aggregate，gel filtration的
: buffer和his purification的一样，就是不含imidazole。还有就是蛋白在柱子里
: aggregate后都跑哪里去了，洗脱不下来吗。
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a******a
发帖数: 68 | 7 搜到一本书，里面如是说：
two reasons: the desired protein may be moderately absorbed to the column so
that its elution occurs after Vt in a very broad peak that is difficult to
distinguish from noise in the baseline. If this is the case, a protein
solubilization agent such as a nonionic detergent or a modest concentration
of a protein denaturant should be added to the chromatographic solvent. A
second possibility involves the dissociation of a functional protein complex
into discrete proteins of different MW in which none of the dissociated
proteins retains the function. Mixing aliquots from different fractions
should facilitate complexation of the component proteins and restoration of
the function.
个人同意楼上说的留在柱子上的说法，可能性比较大，要么换一个孔径尺寸的树脂看看
？如果真的是蛋白解体了，你是否跑胶能看到不同的条带？ |
m*******8
发帖数: 256 | 8 程序刚开始run,基线就从0跳到了30mAU，第一个出来的峰也就是40多左右，没有特别高
的峰。我感觉蛋白解体的可能性比较小，跑胶的时候能隐约看到目的带，其他地方没有
带。 |
a****k
发帖数: 1130 | 9 写下你用的buffer吧
【在 m*******8 的大作中提到】
: 程序刚开始run,基线就从0跳到了30mAU，第一个出来的峰也就是40多左右，没有特别高
: 的峰。我感觉蛋白解体的可能性比较小，跑胶的时候能隐约看到目的带，其他地方没有
: 带。
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m*******8
发帖数: 256 | 10 his elution: 20mM Tris 8.0, 150mM Nacl,300mM imidazole; SEC buffer: 20mM
Tris, 150mM Nacl, 1mM DTT. |
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a****k
发帖数: 1130 | 11 看起来没什么问题呀。要是我的话，可能会重新用20% ethanol好好洗一遍柱子，然后
用buffer再重新equilibrate一下。试着加一点点detergent，比如tween-20看看。再不
行就调下pH吧
【在 m*******8 的大作中提到】
: his elution: 20mM Tris 8.0, 150mM Nacl,300mM imidazole; SEC buffer: 20mM
: Tris, 150mM Nacl, 1mM DTT.
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l**********1
发帖数: 5204 | 12 RE LZ
是膜蛋白的话 浓缩比 是否 合适?
pls refer GOOGLE BOOK:
Membrane Protein Protocols: Expression, Purification, and ... - Page 71 -
Google Books Result
http://books.google.co.uk/books?isbn=159259400X
by
Barry Steven Selinsky - 2003 - Science
The Sf9 insect cell-baculovirus expression system offers several advantages
in ... The Sf9 cells do not require any CO2 incubator and grow rapidly at
room
【在 m*******8 的大作中提到】
: 多谢回复！我把所有的fractions汇集重新浓缩了，没有蛋白。Load柱子之前没有过滤
: 。现在也怀疑是不是aggregate了，但是想不明白为何会aggregate，gel filtration的
: buffer和his purification的一样，就是不含imidazole。还有就是蛋白在柱子里
: aggregate后都跑哪里去了，洗脱不下来吗。
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m*******8
发帖数: 256 | |
l**********1
发帖数: 5204 | 14 quit wet bio/just Move on
Mitbbs BioJailBreak club link:
http://www.mitbbs.com/club_bbsdoc/biojailbreak.html
【在 m*******8 的大作中提到】
: 谢谢大家，现在有恐惧症了，不敢上样。
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b***n
发帖数: 36 | 15 哥们，我有遇到过跟你类似的问题，蛋白跑着跑着就跑没了
后来发现是提出来的蛋白本身就不大稳定，容易形成寡聚（跑ＨＰＬＣ可以看出问题）
很大的一部分直接就聚集在Ｓ２００的上端的ｆｉｌｔｅｒ上了。
提高点盐浓度有些帮助，不过帮助不大
你的实验目的是啥呢？
我的主要是为了除盐纯化，所以后来改用５ＭＬ的Hitrap Desalting Column来跑，
基本上就不损失了
很能理解好不容易用昆虫细胞提到点蛋白跑着跑着就跑没了的哀伤，，，，，
然后，请教了做结晶的童鞋，基本上都是说这种事情是由蛋品决定的，，，如果不是非
玩不可的话，能不能换一个蛋白呢，，， |
m*******8
发帖数: 256 | 16
多谢哥们，这个解释比较合理！我的样品浓缩以后看起来是比较黏，不知道我把样品稀
释一下，分几次过柱子能不能好一些。我的蛋白是要拿去结晶的，我们本来是做发育的
实验室，现在让我搞蛋白结构，真是费劲。
【在 b***n 的大作中提到】
: 哥们，我有遇到过跟你类似的问题，蛋白跑着跑着就跑没了
: 后来发现是提出来的蛋白本身就不大稳定，容易形成寡聚（跑ＨＰＬＣ可以看出问题）
: 很大的一部分直接就聚集在Ｓ２００的上端的ｆｉｌｔｅｒ上了。
: 提高点盐浓度有些帮助，不过帮助不大
: 你的实验目的是啥呢？
: 我的主要是为了除盐纯化，所以后来改用５ＭＬ的Hitrap Desalting Column来跑，
: 基本上就不损失了
: 很能理解好不容易用昆虫细胞提到点蛋白跑着跑着就跑没了的哀伤，，，，，
: 然后，请教了做结晶的童鞋，基本上都是说这种事情是由蛋品决定的，，，如果不是非
: 玩不可的话，能不能换一个蛋白呢，，，
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b******n
发帖数: 4225 | 17 这里扯开一点，这种异源表达的蛋白能代表多少in vivo蛋白的结构很是问题
过量表达的很多蛋白都或多或少有folding的问题
去年我参加一个年会，一个蛋白结构的学者在台上侃侃而谈他研究的蛋白结构
但是所鉴定的重要位点让台下很多做功能的科学家很不满意
跟现有的实验数据太不吻合了
群起而攻之问得搞结构的很尴尬，无言以对
【在 m*******8 的大作中提到】
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: 多谢哥们，这个解释比较合理！我的样品浓缩以后看起来是比较黏，不知道我把样品稀
: 释一下，分几次过柱子能不能好一些。我的蛋白是要拿去结晶的，我们本来是做发育的
: 实验室，现在让我搞蛋白结构，真是费劲。
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b******e
发帖数: 88 | 18 你要是有大的prep grade的柱子比如26/60可以试试不浓缩直接过柱子
我觉得很有可能是你的蛋白浓缩以后已经不happy了，甚至开始precipitate然后被FPLC
里面的filter给滤了，你最后那个峰八成是imidazole，这也解释了为什么你的蛋白不
happy，因为concentrator浓缩事实上也会提高imidazole浓度
我的经验是一根affinity后直接用concentrator浓缩的方法很多情况下对蛋白不是太好
，但是可以用别的方法曲线救国，比方说可以过一根IEC，这样会除去imidazole，出来
的峰也会非常高，不需要浓缩就可以直接上SEC，SEC过后出来的蛋白很多就可以正常浓
缩了
【在 m*******8 的大作中提到】
:
: 多谢哥们，这个解释比较合理！我的样品浓缩以后看起来是比较黏，不知道我把样品稀
: 释一下，分几次过柱子能不能好一些。我的蛋白是要拿去结晶的，我们本来是做发育的
: 实验室，现在让我搞蛋白结构，真是费劲。
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b******e
发帖数: 88 | 19 我觉得你说的这个例子并不能说明recombinant protein不代表endogenous protein的
问题
而是一个类似于scientific misconduct的问题
因为这年头做结构的也要讲一个完整的故事（不然JBC都不收），问题是好不容易解出
来的结构并不一定都有那么多insight into the mechanism of xxx，或者说一时半会
儿看不出来。很多时候这就逼得结构生物学家赶鸭子上架，比如看到一个磷酸化位点就
敢说这个是调控的关键，也不顾（其实是没顾过来）跟biochem的数据是不是吻合。
至于recombinant是不是跟endogenous一样的问题，这当然不能完全证实或证伪。但我
想现在有不少关于表达recombinant multi-subunit complex的文章，这么大的复合体
（十几甚至几十个subunits，几个MegaDa的大小）都能被成功表达，活性或者功能都能
跟endogenous的一样，这已经很能说明recombinant蛋白的有效性了。
【在 b******n 的大作中提到】
: 这里扯开一点，这种异源表达的蛋白能代表多少in vivo蛋白的结构很是问题
: 过量表达的很多蛋白都或多或少有folding的问题
: 去年我参加一个年会，一个蛋白结构的学者在台上侃侃而谈他研究的蛋白结构
: 但是所鉴定的重要位点让台下很多做功能的科学家很不满意
: 跟现有的实验数据太不吻合了
: 群起而攻之问得搞结构的很尴尬，无言以对
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b******y
发帖数: 627 | 20 It is possible that your protein is still in the column. Try to wash it
using half salt. |
i*****g
发帖数: 11893 | 21 用western 收集各个点查一查
到处都没有了，就是被降解了 |
