d**********9
发帖数: 981 | 1 4K的大片段要连载体，有什么秘诀没？
多谢多谢了 |
d**p
发帖数: 149 | 2 4kb is not a 大片段. Just regular cloning
【在 d**********9 的大作中提到】
: 4K的大片段要连载体，有什么秘诀没？
: 多谢多谢了
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s******r
发帖数: 2876 | 3 这个很普通。
【在 d**********9 的大作中提到】
: 4K的大片段要连载体，有什么秘诀没？
: 多谢多谢了
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c*********r
发帖数: 1312 | 4 搭车问一下，9.5 kb大片段克隆有高招没？光PCR就快搞死了。。。
胶回收用kit怎么都回收不够，估计是洗脱不下来。刚订了一个Zymo的Zymoclean™
; Large Fragment DNA Recovery Kit在路上。还有什么要准备的？ |
a********k
发帖数: 2273 | 5 分两段PCR，做3-way ligation。
8482
【在 c*********r 的大作中提到】
: 搭车问一下，9.5 kb大片段克隆有高招没？光PCR就快搞死了。。。
: 胶回收用kit怎么都回收不够，估计是洗脱不下来。刚订了一个Zymo的Zymoclean™
: ; Large Fragment DNA Recovery Kit在路上。还有什么要准备的？
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b******n
发帖数: 4225 | 6 找个外包吧，如果做起来实在吃力的话
花一个月时间在这上面还不如干点别的
8482
【在 c*********r 的大作中提到】
: 搭车问一下，9.5 kb大片段克隆有高招没？光PCR就快搞死了。。。
: 胶回收用kit怎么都回收不够，估计是洗脱不下来。刚订了一个Zymo的Zymoclean™
: ; Large Fragment DNA Recovery Kit在路上。还有什么要准备的？
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c*********r
发帖数: 1312 | 7 谢谢，我之前有点担心3-way ligation效率低，想一步搞定。有推荐的protocol吗？
【在 a********k 的大作中提到】
: 分两段PCR，做3-way ligation。
:
: 8482
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c*********r
发帖数: 1312 | 8 多谢建议。外包没有经验，有推荐的公司吗？有点担心老板是否会批准。。。小lab经
费不多，NSF去年的grant现在都没消息。。。
【在 b******n 的大作中提到】
: 找个外包吧，如果做起来实在吃力的话
: 花一个月时间在这上面还不如干点别的
:
: 8482
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z*********8
发帖数: 1203 | 9 clonetec infusion cloning。简单好用啊！ |
c*********r
发帖数: 1312 | 10 手上有这个，就是目的片段搞不到足够量，期待试一下。
使用这个kit克隆大片段，你是用vector:insert molar ratio=1:2(看到不少文章里用
这个比例)，还是按照说明里的加几十ng 100ng那样来做？按照molar ratio 1:2的话，
insert的量要超过说明书里的上限了。
谢谢！
【在 z*********8 的大作中提到】
: clonetec infusion cloning。简单好用啊！
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b*********e
发帖数: 870 | 11 infusion 效率非常高的，根本不用操心什么浓度。我们把整个infusion反应体系压缩
到2ul，就是只用0.4ul infusion mix，剩下的1.6ul就是vector和inserts的回收产物
分配一下。
再说了，你这个4kb也不长啊，你跑胶回收的时候，把洗脱buffer加热一下，洗脱效率
高很多的。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 手上有这个，就是目的片段搞不到足够量，期待试一下。
: 使用这个kit克隆大片段，你是用vector:insert molar ratio=1:2(看到不少文章里用
: 这个比例)，还是按照说明里的加几十ng 100ng那样来做？按照molar ratio 1:2的话，
: insert的量要超过说明书里的上限了。
: 谢谢！
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c*********r
发帖数: 1312 | 12 4 kb是楼主的，我的是9.5 kb。对9.5 kb左右的片段有经验吗？还有就是in-fusion之
前被实验室同学室温放过夜了，影响大吗？把整个反应体系压缩到2 ul可以节省很多啊
！牛！
【在 b*********e 的大作中提到】
: infusion 效率非常高的，根本不用操心什么浓度。我们把整个infusion反应体系压缩
: 到2ul，就是只用0.4ul infusion mix，剩下的1.6ul就是vector和inserts的回收产物
: 分配一下。
: 再说了，你这个4kb也不长啊，你跑胶回收的时候，把洗脱buffer加热一下，洗脱效率
: 高很多的。
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s*****i
发帖数: 315 | 13 你的载体多大，如果载体跟insert差不多大，是很难插入成功的
如果你试了很长时间也没试出来，建议从简单做起，比如说从9.5k里面找到一个好用的
单酶切位点，分两步上去，或是分三步上去，虽然看上去慢但是总体而言反而节省时间。
因为PCR之后要测序，9.5k的就算构建成功，突变率要高于5k的，不如分成几段，放在
几个载体里面测序无误了再连上去。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 4 kb是楼主的，我的是9.5 kb。对9.5 kb左右的片段有经验吗？还有就是in-fusion之
: 前被实验室同学室温放过夜了，影响大吗？把整个反应体系压缩到2 ul可以节省很多啊
: ！牛！
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c*********r
发帖数: 1312 | 14 谢谢回复。载体4k多一点。说的有道理，我再仔细考虑一下。
间。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 你的载体多大，如果载体跟insert差不多大，是很难插入成功的
: 如果你试了很长时间也没试出来，建议从简单做起，比如说从9.5k里面找到一个好用的
: 单酶切位点，分两步上去，或是分三步上去，虽然看上去慢但是总体而言反而节省时间。
: 因为PCR之后要测序，9.5k的就算构建成功，突变率要高于5k的，不如分成几段，放在
: 几个载体里面测序无误了再连上去。
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b*********e
发帖数: 870 | 15 9.5K我做过assembly PCR，但是用普通的酶切连接做的clone。PCR以后，突变率还是挺
高的，还是分段搞好、测序以后，切出来，再连接比较稳妥。
室温过夜，会完蛋吧？酶活就没了啊。压缩到2ul是我的一个同事测试出来的，呵呵。
我们老板是省钱牛人，在他带领下，大家都好有省钱的激情。。。汗~
【在 c*********r 的大作中提到】
: 4 kb是楼主的，我的是9.5 kb。对9.5 kb左右的片段有经验吗？还有就是in-fusion之
: 前被实验室同学室温放过夜了，影响大吗？把整个反应体系压缩到2 ul可以节省很多啊
: ！牛！
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c*********r
发帖数: 1312 | 16 又学习了，多谢！我的9.5kb的片段用NEB的Q5能P出来，就是产量低一些。看样子还是
分段搞的好。
我老板管钱比较严，很多细节会亲自过问，所以能省就省，期待多多分享省钱大法啊！
【在 b*********e 的大作中提到】
: 9.5K我做过assembly PCR，但是用普通的酶切连接做的clone。PCR以后，突变率还是挺
: 高的，还是分段搞好、测序以后，切出来，再连接比较稳妥。
: 室温过夜，会完蛋吧？酶活就没了啊。压缩到2ul是我的一个同事测试出来的，呵呵。
: 我们老板是省钱牛人，在他带领下，大家都好有省钱的激情。。。汗~
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w*****t
发帖数: 179 | 17 我用的是clonetech的INFUSION，载体4KB，连了4个片段进去，是在一个反应，最后大
小11KB，挑了4个有两个阳性。不是很复杂，但是设计引物的时候要费点事，注意5’，
3‘设计的时候不要搞错。
【在 d**********9 的大作中提到】
: 4K的大片段要连载体，有什么秘诀没？
: 多谢多谢了
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z*********8
发帖数: 1203 | 18 用过4段连接，感觉不错，基本挑的每个都是对的。但是这个kit，很有意思，在我们实
验室只有亚洲女生用这个才做的出来，别人做就是死活不出来，我觉得别人做的时候也
挺仔细的，但是就是出不来，其实，我也不知道自己有什么诀窍，就照着protocol来就
有了。还有，就是如果环境湿度比较大的话，不要买那个dry kit（粉末状的），不过
估计现在也不一定生产了。环境湿度大的地方要用买来放下-20冰箱的reagent |
c*********r
发帖数: 1312 | 19 哈，还有这等奇事？克隆完这个大片段，我也需要做几个三四段连接的反应，看来需要
叫上LP来客串一下了。。。
【在 z*********8 的大作中提到】
: 用过4段连接，感觉不错，基本挑的每个都是对的。但是这个kit，很有意思，在我们实
: 验室只有亚洲女生用这个才做的出来，别人做就是死活不出来，我觉得别人做的时候也
: 挺仔细的，但是就是出不来，其实，我也不知道自己有什么诀窍，就照着protocol来就
: 有了。还有，就是如果环境湿度比较大的话，不要买那个dry kit（粉末状的），不过
: 估计现在也不一定生产了。环境湿度大的地方要用买来放下-20冰箱的reagent
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b*********e
发帖数: 870 | 20 不客气啊！省钱大法是需要老板有激情和自己动手修理仪器的能力的啊，我老板热爱修
理玩意儿。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 又学习了，多谢！我的9.5kb的片段用NEB的Q5能P出来，就是产量低一些。看样子还是
: 分段搞的好。
: 我老板管钱比较严，很多细节会亲自过问，所以能省就省，期待多多分享省钱大法啊！
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q*******8
发帖数: 768 | |
k*****n
发帖数: 323 | |
S*******r
发帖数: 530 | 23 我连过10kb的片段，invitrogen有一种专门的感受态用于大片段，电转可能好一点，多
做一些连接梯度。
8482;
【在 c*********r 的大作中提到】
: 搭车问一下，9.5 kb大片段克隆有高招没？光PCR就快搞死了。。。
: 胶回收用kit怎么都回收不够，估计是洗脱不下来。刚订了一个Zymo的Zymoclean™
: ; Large Fragment DNA Recovery Kit在路上。还有什么要准备的？
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