n**********u
发帖数: 77 | 1 这个是我的qPCR标准曲线， 怎么是这样的？不是线性。 共7个梯度，一个梯度3个点：
1 4.496082306
1 4.484809875
1 4.525729656
0.1 5.561143398
0.1 5.41778326
0.1 5.438686371
0.01 5.596251965
0.01 5.594720364
0.01 5.552800655
0.001 5.570918083
0.001 5.653218746
0.001 5.576761723
1E-04 5.676965237
1E-04 5.579387188
1E-04 21.28894424
1E-05 24.55447006
1E-05 24.60056686
1E-05 24.69136047
1E-06 28.44901848
1E-06 27.91756248
1E-06 28.0588932
重复两次了，一样的。 有什么可能的原因呢？ |
m****M
发帖数: 360 | 2 你这信息量太少，你这模板是稀释的质粒，DNA片段还是你总样品的混合样品呢？是
TAQMAN还是SYBRGREEN？是怎么稀释的，１０X还是５X？ 以我将近近１０年的QPCR经验
看，你这后面几个稀释就没有扩增出东西。看样子是SYBRGREEN？你这起始浓度太高，
都４个CYCYLE就出来信号啦。 |
n**********u
发帖数: 77 | 3 模版是稀释的质粒，SYBRGREEN的，10X稀释？ 为什么后面没有p出来呢？我之前把模版
和样品的PCR产物都跑胶了，后面的三组虽然比较淡一点，但是还是有条带的。 我之前
是这样想的：7组的话，就可以把样品的浓度范围包含在内，这个和4cycle没有什么关
系吧，主要是这个基本不是线性的。把后面Ct高的去掉，也不是线性的。
【在 m****M 的大作中提到】
: 你这信息量太少，你这模板是稀释的质粒，DNA片段还是你总样品的混合样品呢？是
: TAQMAN还是SYBRGREEN？是怎么稀释的，１０X还是５X？ 以我将近近１０年的QPCR经验
: 看，你这后面几个稀释就没有扩增出东西。看样子是SYBRGREEN？你这起始浓度太高，
: 都４个CYCYLE就出来信号啦。
|
p****p
发帖数: 3360 | 4 其实你最后的两组稀释才是线性的，是比较好的结果。
如果你的primer比较好，每轮能达到90％以上的扩增率的话，10倍的稀释应该增加Ct大
约3.3－3.6之间。楼上的说你模板浓度太高应该没有错。不过Ct值小于24的都不在线性
范围内是有点奇怪(比如E-4应该Ct~21，0.001稀释应该17－18左右。其它更高的模板浓
度就不要用了。）。
4-5个cycle就出来信号，你没有办法定baseline，估计连自动baseline都很有问题。
【在 n**********u 的大作中提到】
: 模版是稀释的质粒，SYBRGREEN的，10X稀释？ 为什么后面没有p出来呢？我之前把模版
: 和样品的PCR产物都跑胶了，后面的三组虽然比较淡一点，但是还是有条带的。 我之前
: 是这样想的：7组的话，就可以把样品的浓度范围包含在内，这个和4cycle没有什么关
: 系吧，主要是这个基本不是线性的。把后面Ct高的去掉，也不是线性的。
|
m****M
发帖数: 360 | 5 对不起，没有仔细看你的数值，我把后两组CT看成了３４， ３８。你前面的稀释绝对
有问题。重新稀释再做做看吧。最好从１０左右看到信号。不过也没有关系，分析时可
以把CT小的去掉。 |
n**********u
发帖数: 77 | 6 我10倍梯度稀释的时候一定是没有问题的，因为我稀释过两次，两次的结果都是前四组
ct小于10，且非线性。 如果说前面的不用的话怎么把样品的范围包括呢？ 而且我的样
品的ct值也是不稳定的，且有的小于10.
这个是我的样品的值：（每三个一组，共8组）
5.037132263
21.26654053
5.611187935
5.679401398
21.51596642
21.64349174
22.95340919
22.86884308
22.88713455
5.612506866
21.76369476
22.26181984
5.029410362
4.812356949
4.591382504
5.502806187
20.2941761
5.094372749
23.19475555
22.76948166
22.86292458
4.901602745
21.36574745
5.178225517
【在 p****p 的大作中提到】
: 其实你最后的两组稀释才是线性的，是比较好的结果。
: 如果你的primer比较好，每轮能达到90％以上的扩增率的话，10倍的稀释应该增加Ct大
: 约3.3－3.6之间。楼上的说你模板浓度太高应该没有错。不过Ct值小于24的都不在线性
: 范围内是有点奇怪(比如E-4应该Ct~21，0.001稀释应该17－18左右。其它更高的模板浓
: 度就不要用了。）。
: 4-5个cycle就出来信号，你没有办法定baseline，估计连自动baseline都很有问题。
|
n**********u
发帖数: 77 | 7 在附上一句，刚才做完了第三次实验，无奈仍然是一样的结果：
0.1 5.787840843
0.1 5.888357639
0.1 5.543690681
0.01 6.571349144
0.01 6.605658531
0.01 6.556361198
0.001 6.80411005
0.001 6.599585533
0.001 6.589509487
1E-04 6.875332832
1E-04 6.537699699
1E-04 6.553117275
1E-05 25.38688278
1E-05 6.44115591
1E-05 6.519612789
1E-06 28.60762405
1E-06 28.89318085
1E-06 28.75268936
1E-07 30.38112831
1E-07 30.44132042
1E-07 30.48270035
样品：
sample 1 6.308719635
sample 1 5.658977985
sample 1 5.744049549
sample 2 5.993648052
sample 2 22.11792564
sample 2 6.835368633
sample 3 6.050149441
sample 3 23.41438103
sample 3 22.93060684
sample 4 5.858206749
sample 4 22.75257874
sample 4 22.18687248
sample 5 5.266860962
sample 5 5.737222195
sample 5 5.788927078
sample 6 5.894687653
sample 6 20.78487587
sample 6 6.503214836
sample 7 5.991484165
sample 7 23.53564453
sample 7 22.49239731
sample 8 6.145753384
sample 8 22.57501984
sample 8 22.00671768 |
m****M
发帖数: 360 | 8 如果你确定你稀释是正确的，而且引物没有任何问题，我建议你换新的２X qPCR
Master Mix，或换另外一个公司的。同时，看看最近用同一台机器的其他人的扩增如何
，最近qPCR machine是否Calibrate过。 |
m****M
发帖数: 360 | 9 我是这样稀释我的标准曲线的：
大体确定一个起始浓度，然后混合好 （Vortex离心，Vortex离心，至少两次）。然后
在10个新管子里加450微升的PCR级的水，分别表上10x 的浓度。从混合好的管子里取50
微升，加到第一个管子（0.1x），然后混合好 （Vortex, 离心，Vortex, 离心，至少
两次）。从这0.1x 管子里取出５０微升，加到第二个管子（0.01x），然后混合好 （
Vortex离心，Vortex离心，至少两次）。依此稀释下去。 做qPCR时，所有的稀释浓度
都加上。根据扩增的Ct值取几个最好的浓度作以后的标准曲线用
注意：１。体积一定要至少５０微升，这样减少pipetting误差。２。一定要混合的非
常好。Vortex离心，Vortex离心，至少两次。
如果可能，可以用回收的DNA片断。有人用所有样品的混合物，然后加不同的上样量以
形成不同的浓度梯度，这样有点麻烦, 而且cDNA量不多, 非常珍贵时，最好不用此方法
。 |
s******y
发帖数: 28562 | 10 很可能就是稀释的时候不准确。
我的建议是稀释之后重新测一次D260来修正浓度
【在 n**********u 的大作中提到】
: 这个是我的qPCR标准曲线， 怎么是这样的？不是线性。 共7个梯度，一个梯度3个点：
: 1 4.496082306
: 1 4.484809875
: 1 4.525729656
: 0.1 5.561143398
: 0.1 5.41778326
: 0.1 5.438686371
: 0.01 5.596251965
: 0.01 5.594720364
: 0.01 5.552800655
|
|
|
m****M
发帖数: 360 | 11 前面一两个浓度高的还准些，后面的稀释倍数高的, 测浓度一点都不准。
【在 s******y 的大作中提到】
: 很可能就是稀释的时候不准确。
: 我的建议是稀释之后重新测一次D260来修正浓度
|
n**********u
发帖数: 77 | 12 我的片段大小是150bp左右，反应的循环设置是：95度 15s；50度 30s， 45个cycles.
这个有问题吗？ 大家对于我的稀释的问题不要在纠结了。我认为不是这个问题，而是
反应的问题。 因为我的样品的Ct值也是不一样，而且三个平行反应中有的差距很大。 |
j*****9
发帖数: 716 | 13 加了melting curve步骤了没有？看每个孔的melting curve，产物是否单一，或者把产
物跑胶检样，看条带是否单一，引物有没有二聚体等等
【在 n**********u 的大作中提到】
: 这个是我的qPCR标准曲线， 怎么是这样的？不是线性。 共7个梯度，一个梯度3个点：
: 1 4.496082306
: 1 4.484809875
: 1 4.525729656
: 0.1 5.561143398
: 0.1 5.41778326
: 0.1 5.438686371
: 0.01 5.596251965
: 0.01 5.594720364
: 0.01 5.552800655
|
q***7
发帖数: 144 | 14 你们不要再揪结楼主的稀释技术了。这么低级的技术都不相信楼主，看看楼主生气吧。
看来你很自信自己的稀释，如果是这样，你真的要看看试剂和仪器了。
脾气好点，你这是求大家的帮助呢。呵呵
问题解决了给大家通知一下，让＝大家也学习学习 |
q***7
发帖数: 144 | |
n**********u
发帖数: 77 | 16 我刚才把qpcr的产物跑了胶，100bp一下，有很强的primer的带，我的引物的终浓度用
得是2uM，因为我用的是简并引物，一个是96，一个是32的简并度。 应该和质粒的质量
没有什么关系，因为样品的Ct值有的也是很小。 会不会是我的引物的浓度太大了？ 引
物在体系里面也会产生荧光吗？
【在 q***7 的大作中提到】
: 你们不要再揪结楼主的稀释技术了。这么低级的技术都不相信楼主，看看楼主生气吧。
: 看来你很自信自己的稀释，如果是这样，你真的要看看试剂和仪器了。
: 脾气好点，你这是求大家的帮助呢。呵呵
: 问题解决了给大家通知一下，让＝大家也学习学习
|
r*******e
发帖数: 680 | 17 三个平行反应中有的差距很大
1. loading problem
2. bad PCR (if use sybr green)
.
【在 n**********u 的大作中提到】
: 我的片段大小是150bp左右，反应的循环设置是：95度 15s；50度 30s， 45个cycles.
: 这个有问题吗？ 大家对于我的稀释的问题不要在纠结了。我认为不是这个问题，而是
: 反应的问题。 因为我的样品的Ct值也是不一样，而且三个平行反应中有的差距很大。
|
s******y
发帖数: 28562 | 18 对于SYBRGREEN， 你能在胶上看到的东西，机器也都能看到。
所以这个很可能就是primer dimer 引起的。
我看了一下你用的condition, 建议你降低引物浓度，并升高温度（我会用至少55度吧
）。因为在比较高的温度下读荧光的时候，引物的荧光会小很多。
【在 n**********u 的大作中提到】
: 我刚才把qpcr的产物跑了胶，100bp一下，有很强的primer的带，我的引物的终浓度用
: 得是2uM，因为我用的是简并引物，一个是96，一个是32的简并度。 应该和质粒的质量
: 没有什么关系，因为样品的Ct值有的也是很小。 会不会是我的引物的浓度太大了？ 引
: 物在体系里面也会产生荧光吗？
|
l***s
发帖数: 841 | 19 这浓度也太高了吧。为什么不用标准protocol？要降低10倍。还有primer dimer 的话
，重新设计引物。从这里找：
http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
【在 n**********u 的大作中提到】
: 我刚才把qpcr的产物跑了胶，100bp一下，有很强的primer的带，我的引物的终浓度用
: 得是2uM，因为我用的是简并引物，一个是96，一个是32的简并度。 应该和质粒的质量
: 没有什么关系，因为样品的Ct值有的也是很小。 会不会是我的引物的浓度太大了？ 引
: 物在体系里面也会产生荧光吗？
|
t******o
发帖数: 7 | 20 你没有贴你的扩增曲线，我觉得你的模板浓度太高了，可以看看你的扩增曲线，估计前
几个都是锯齿形的，这样影响自动生成的baseline，可以先看看扩增曲线，看从哪个浓
度开始才是光滑的s曲线，然后把前几个样品圈掉，baseline改了估计ct会有一定改变
。估计你之后还要然后按需要做稀释，比如找1：5这样的稀释度。样本很多时候也是应
该稀释的，如果还有很低ct的估计也是太浓了。
【在 n**********u 的大作中提到】
: 这个是我的qPCR标准曲线， 怎么是这样的？不是线性。 共7个梯度，一个梯度3个点：
: 1 4.496082306
: 1 4.484809875
: 1 4.525729656
: 0.1 5.561143398
: 0.1 5.41778326
: 0.1 5.438686371
: 0.01 5.596251965
: 0.01 5.594720364
: 0.01 5.552800655
|
|
|
m****M
发帖数: 360 | 21 我曾经试过一些我们感兴趣的基因的引物，有将近一半不行。还不如我自己设计的CT值
低。你看他们给的扩增曲线没有？CT值和扩增曲线看着挺好的，但是都是给的一个WELL
的。我完全根据他们的，好多都比他们给的要多几个CT，有的根本没有扩增。最要命的
是这些引物没有考虑基因的ISOFORM。只是检测一个ISOFORM，或几个ISOFORM相同的地
方，有时差别不是很明星。我曾经遇到很多情况，就是某些基因的某些ISOFORM表达差
异还是很大的。
【在 l***s 的大作中提到】
: 这浓度也太高了吧。为什么不用标准protocol？要降低10倍。还有primer dimer 的话
: ，重新设计引物。从这里找：
: http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
|
t******o
发帖数: 7 | 22 但看样本数值，比如第一个平行管相差很大，我感觉两个5的是baseline的取值没有划
在对数增长期造成的，你可以手动提高baseline的值再看看。 |
l***s
发帖数: 841 | 23 That's weird. We have tried thousands of primers from the database, and they
mostly worked well (>90%). As to isoforms, the primers were designed to
cover all known isoforms of a gene based on NCBI RefSeq. This was done by
designing primers from the common regions of all isoforms. Not sure why your
Ct values are low. Did you follow the protocol from the website (primer
conc, annealing temperature, etc)? Another consideration is that not all
genes are expressed in all cells.
WELL
【在 m****M 的大作中提到】
: 我曾经试过一些我们感兴趣的基因的引物，有将近一半不行。还不如我自己设计的CT值
: 低。你看他们给的扩增曲线没有？CT值和扩增曲线看着挺好的，但是都是给的一个WELL
: 的。我完全根据他们的，好多都比他们给的要多几个CT，有的根本没有扩增。最要命的
: 是这些引物没有考虑基因的ISOFORM。只是检测一个ISOFORM，或几个ISOFORM相同的地
: 方，有时差别不是很明星。我曾经遇到很多情况，就是某些基因的某些ISOFORM表达差
: 异还是很大的。
|
c********r
发帖数: 189 | 24 should be 2X dilution instead of 10X dilution? |
n********e
发帖数: 1630 | 25 看看melting curve 就知道扩增的结果的质量了。。如果有几个不同的扩增片段，
standard curve肯定是不好。 |
n********e
发帖数: 1630 | 26 可能你的plasmid 有问题，重新准备样品，做稀释 |
n********e
发帖数: 1630 | 27 可能你的plasmid 有问题，重新准备样品，做稀释 |
C*******e
发帖数: 4348 | 28 借楼说个题外话
用质粒做模板，做标准曲线的话
应该用单酶切、线性化的质粒
因为不cDNA模板都是线性的
环状的模板扩增跟线性有所不同
（不过我不是做这个动力学的。。。。无法详细说明）
所以建议还是质粒线性化再用 |
m*****z
发帖数: 1451 | 29 引物浓度太高啦，有什么特殊原因要用这么高浓度吗？
【在 n**********u 的大作中提到】
: 我刚才把qpcr的产物跑了胶，100bp一下，有很强的primer的带，我的引物的终浓度用
: 得是2uM，因为我用的是简并引物，一个是96，一个是32的简并度。 应该和质粒的质量
: 没有什么关系，因为样品的Ct值有的也是很小。 会不会是我的引物的浓度太大了？ 引
: 物在体系里面也会产生荧光吗？
|
m*****z
发帖数: 1451 | 30 最近也在用这个bank的primer，的确有好几个CT值太高，有个居然non-template的CT是
32！人格保证绝对没污染。
WELL
【在 m****M 的大作中提到】
: 我曾经试过一些我们感兴趣的基因的引物，有将近一半不行。还不如我自己设计的CT值
: 低。你看他们给的扩增曲线没有？CT值和扩增曲线看着挺好的，但是都是给的一个WELL
: 的。我完全根据他们的，好多都比他们给的要多几个CT，有的根本没有扩增。最要命的
: 是这些引物没有考虑基因的ISOFORM。只是检测一个ISOFORM，或几个ISOFORM相同的地
: 方，有时差别不是很明星。我曾经遇到很多情况，就是某些基因的某些ISOFORM表达差
: 异还是很大的。
|
