s********x 发帖数: 472 | 1 最近制备了一批~20 constructs,中提QIAGENT试剂盒制备,其中有2个construct在小
提时没有任何问题,但是一到中提时就产量巨低-低到几乎没什么DNA。
换了几个克隆,试过中提和大提都产量巨低。
我用的是TOP10的菌种,后来换了DH5alpha和Stella cell,或用Chl+增加copy number
都不好用。
以前也遇到类的问题,当时就是摇了大量的菌,DNA量总算够了,但是struggle了好些
天。
想请教一下大牛这个到底是什么问题,为什么小提时没问题,中提大提时就产量低。具
体可能是什么原理?有什么解决方法。万分感谢。 |
b**********8 发帖数: 349 | 2 我以前也碰到过这个问题,你那个产量低的vector是什么?
我曾经碰到两个质粒,一个是基于pECE的表达质粒,另一个是用pMir-reporter 做的一
个基因的3‘UTR报告基因质粒,这两个质粒做midiprep的产量每次最多只有30ug,换感
受态都不行,老板还总以为是我自己的问题,后来换了别的人提,也是同样的问题 |
s******y 发帖数: 28562 | 3 小提和中大提的培养液量不同,生长曲线不一样。
建议要么在中大提培养的时候增加抗生素用量,要么你就摇上10~20个小提的管,
然后合在一起做中提
number
【在 s********x 的大作中提到】 : 最近制备了一批~20 constructs,中提QIAGENT试剂盒制备,其中有2个construct在小 : 提时没有任何问题,但是一到中提时就产量巨低-低到几乎没什么DNA。 : 换了几个克隆,试过中提和大提都产量巨低。 : 我用的是TOP10的菌种,后来换了DH5alpha和Stella cell,或用Chl+增加copy number : 都不好用。 : 以前也遇到类的问题,当时就是摇了大量的菌,DNA量总算够了,但是struggle了好些 : 天。 : 想请教一下大牛这个到底是什么问题,为什么小提时没问题,中提大提时就产量低。具 : 体可能是什么原理?有什么解决方法。万分感谢。
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s******s 发帖数: 13035 | 4 //nod
中提和接种方法很有关系。要么就是多摇点tube
【在 s******y 的大作中提到】 : 小提和中大提的培养液量不同,生长曲线不一样。 : 建议要么在中大提培养的时候增加抗生素用量,要么你就摇上10~20个小提的管, : 然后合在一起做中提 : : number
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s******y 发帖数: 28562 | 5 对,你说的非常好。关键就是这个接种方法不同。小提一般都是从板上的菌点接种,
而中提是在已经长起来的液体里接种。
其实在板上长的时候因为菌落里面有那个biofilm, 所以只要最底下一层是有抗性的携
带质粒的菌,顶上肯定也就是。而且零星长起来的突变抗性菌没有办法跑过去占他们的
地盘,所以菌种比较单纯。但是在摇的菌液里情况就完全不一样了,突变体很快就能取
代携带质粒的菌体,因为携带质粒其实对于细菌而言就和我们被感染了寄生虫是类似的
,都是个负担。
有一个小窍门就是把一个单克隆挑出来在板上满满的涂一大圈,然后长起来后把整层都
刮下来放到培养液里去再摇个8小时就可以做中提了。
【在 s******s 的大作中提到】 : //nod : 中提和接种方法很有关系。要么就是多摇点tube
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q***7 发帖数: 144 | 6 You can try this company's Ultrapure Midi and Maxi which generate ultrapure
plasmid DNA and is much cheaper than Qiagen kit.
http://www.greenbioresearch.com/midi-maxi-ultrapure-plasmid-ext |
B****n 发帖数: 22 | 7 说一点我的经历,或许对楼主有帮助
我去年也在大提pLKO质粒遇到同样的问题,产量很低。因为当时有人警告我说这个质粒
拷贝数很低要摇很多菌,所以我先挑一个单菌落放在5ml培养基里过夜摇,然后转到1L
的大瓶里放大。结果很悲惨。
后来发现没那么邪乎,直接挑一个单菌落放在250ml过夜摇就能提到1-2mg。
我建议:
1.每次都重新转化感受态
2.不要经过小摇,直接单菌落接种 |
z********i 发帖数: 610 | 8 这种情况我也遇到过很多次。小提的时候一点问题都没有,中提的时候什么都没有,哪
怕是用250ml也提不出来。我一般都是重新转化,或者划平板,挑单克隆。就向楼上说
的一样。 |
L*****t 发帖数: 56 | 9 Amp抗型的bla基因是分泌型beta内酰胺酶, Studier的文章里提到过菌液OD=0.2-0.3的
时候培养基里的Amp已经没有了,补加也会马上被消化掉,唯一的办法是把菌液离心后
用新培养基重旋,否则肯定会掉质粒。
【在 s******y 的大作中提到】 : 对,你说的非常好。关键就是这个接种方法不同。小提一般都是从板上的菌点接种, : 而中提是在已经长起来的液体里接种。 : 其实在板上长的时候因为菌落里面有那个biofilm, 所以只要最底下一层是有抗性的携 : 带质粒的菌,顶上肯定也就是。而且零星长起来的突变抗性菌没有办法跑过去占他们的 : 地盘,所以菌种比较单纯。但是在摇的菌液里情况就完全不一样了,突变体很快就能取 : 代携带质粒的菌体,因为携带质粒其实对于细菌而言就和我们被感染了寄生虫是类似的 : ,都是个负担。 : 有一个小窍门就是把一个单克隆挑出来在板上满满的涂一大圈,然后长起来后把整层都 : 刮下来放到培养液里去再摇个8小时就可以做中提了。
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l**********1 发帖数: 5204 | 10 mark.
【在 L*****t 的大作中提到】 : Amp抗型的bla基因是分泌型beta内酰胺酶, Studier的文章里提到过菌液OD=0.2-0.3的 : 时候培养基里的Amp已经没有了,补加也会马上被消化掉,唯一的办法是把菌液离心后 : 用新培养基重旋,否则肯定会掉质粒。
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s*****v 发帖数: 274 | 11 Can you just stop posting this bullshit everywhere?
ultrapure
【在 q***7 的大作中提到】 : You can try this company's Ultrapure Midi and Maxi which generate ultrapure : plasmid DNA and is much cheaper than Qiagen kit. : http://www.greenbioresearch.com/midi-maxi-ultrapure-plasmid-ext
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m******e 发帖数: 459 | 12 非常同意这位仁兄的看法,对于Amp抗性菌,先小量摇菌再扩大培养是下策
【在 s******y 的大作中提到】 : 对,你说的非常好。关键就是这个接种方法不同。小提一般都是从板上的菌点接种, : 而中提是在已经长起来的液体里接种。 : 其实在板上长的时候因为菌落里面有那个biofilm, 所以只要最底下一层是有抗性的携 : 带质粒的菌,顶上肯定也就是。而且零星长起来的突变抗性菌没有办法跑过去占他们的 : 地盘,所以菌种比较单纯。但是在摇的菌液里情况就完全不一样了,突变体很快就能取 : 代携带质粒的菌体,因为携带质粒其实对于细菌而言就和我们被感染了寄生虫是类似的 : ,都是个负担。 : 有一个小窍门就是把一个单克隆挑出来在板上满满的涂一大圈,然后长起来后把整层都 : 刮下来放到培养液里去再摇个8小时就可以做中提了。
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p********i 发帖数: 116 | 13 Carbenicillin 会有帮助吗?
【在 L*****t 的大作中提到】 : Amp抗型的bla基因是分泌型beta内酰胺酶, Studier的文章里提到过菌液OD=0.2-0.3的 : 时候培养基里的Amp已经没有了,补加也会马上被消化掉,唯一的办法是把菌液离心后 : 用新培养基重旋,否则肯定会掉质粒。
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H*******i 发帖数: 196 | 14 CB只是稳定/难降解一些,但对AmpR/Bla没区别,这个问题的关键AmpR/Bla是个分泌蛋
白,而且只有分泌了才产生抗性
我有时候做克隆有意避免使用Amp。。 |
n********e 发帖数: 1630 | 15 我用50ml的培养液,不知道是中提还是大提。我直接从板上挑单克隆进入50ml,
overnight,产量500-1000ug |
m*****z 发帖数: 1451 | 16 说清楚,小提的箘液跟中提的是同一瓶箘液吗?
如果不是同一瓶,那可能是小提的箘液长过了amp失效
直接划板挑单菌落到100-250ml培养过夜就没有问题了。
number
【在 s********x 的大作中提到】 : 最近制备了一批~20 constructs,中提QIAGENT试剂盒制备,其中有2个construct在小 : 提时没有任何问题,但是一到中提时就产量巨低-低到几乎没什么DNA。 : 换了几个克隆,试过中提和大提都产量巨低。 : 我用的是TOP10的菌种,后来换了DH5alpha和Stella cell,或用Chl+增加copy number : 都不好用。 : 以前也遇到类的问题,当时就是摇了大量的菌,DNA量总算够了,但是struggle了好些 : 天。 : 想请教一下大牛这个到底是什么问题,为什么小提时没问题,中提大提时就产量低。具 : 体可能是什么原理?有什么解决方法。万分感谢。
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s********n 发帖数: 2939 | 17 如果lz是bla抗性基因的话这个解释最靠谱
【在 L*****t 的大作中提到】 : Amp抗型的bla基因是分泌型beta内酰胺酶, Studier的文章里提到过菌液OD=0.2-0.3的 : 时候培养基里的Amp已经没有了,补加也会马上被消化掉,唯一的办法是把菌液离心后 : 用新培养基重旋,否则肯定会掉质粒。
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L*****t 发帖数: 56 | 18 wolfson.huji.ac.il/expression/local/bacteria/studierautoinduced.pdf
附上Studier原文的链接,这篇文章推荐大家都看看,就算不是做原核表达的也有很多
有用的信息:
1. bla蛋白导致amp失效的问题,这个之前说过了。
2. Kan抗性在高磷酸盐条件下不能用来做筛选,除非把卡那霉素用量增加2-4倍
3. 限制摇瓶生长密度的主要是镁离子和供氧
如果问题集中出现在个别construct上的话还有一种可能就是蛋白毒性很强,超微量的
表达都有可能导致溶菌。(有没有原核Promoter不是决定性因素,pLysS里面的T7溶菌
酶方向反了,但是正好能提供稳定微量表达不到致死量的蛋白)
【在 s********n 的大作中提到】 : 如果lz是bla抗性基因的话这个解释最靠谱
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