a******n
发帖数: 392 | 1 Southern做出来结果是一片smear，看不出条带。有意思的是没有标记的分子量Marker
倒是显示出条带来了。最有可能是什么问题？探针的特异性出问题了？我是用DIG PCR
标记的500bp的探针。探针电泳条带挺清晰的。 |
s******y
发帖数: 17729 | 2 探针特异性不好，换探针
更靠谱的做法是
果断上p32，dig那玩意儿做出来不靠谱，很多时候都是稀里糊涂一片
Marker
PCR
【在 a******n 的大作中提到】
: Southern做出来结果是一片smear，看不出条带。有意思的是没有标记的分子量Marker
: 倒是显示出条带来了。最有可能是什么问题？探针的特异性出问题了？我是用DIG PCR
: 标记的500bp的探针。探针电泳条带挺清晰的。
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a******n
发帖数: 392 | 3 新实验室，没有做同位素的许可也没办法。是不是延长谈针的长度会有用？
【在 s******y 的大作中提到】
: 探针特异性不好，换探针
: 更靠谱的做法是
: 果断上p32，dig那玩意儿做出来不靠谱，很多时候都是稀里糊涂一片
:
: Marker
: PCR
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i*********0
发帖数: 915 | 4 你的probe是从载体里面切的么？
我以前做Southern也遇到这样的问题。我的probe也能在marker上产生signal，但是在
我的样品上是特异的带。
我估计是切下来的探针也带了一点plasimd的序列，和marker有cross reaction。
不过你在样品上看到smear带，可能是washing的不彻底，或者探针不特异。 |
a******n
发帖数: 392 | 5 我的probe是用genomic DNA做 模板通过PCR获得的。
【在 i*********0 的大作中提到】
: 你的probe是从载体里面切的么？
: 我以前做Southern也遇到这样的问题。我的probe也能在marker上产生signal，但是在
: 我的样品上是特异的带。
: 我估计是切下来的探针也带了一点plasimd的序列，和marker有cross reaction。
: 不过你在样品上看到smear带，可能是washing的不彻底，或者探针不特异。
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s******y
发帖数: 17729 | 6 用处不大
主要还是由于dig背景信号太大，也就是静噪比的问题
这个就的多摸条件了
同位素相对来说容易些，我以前做生物素，真的是费尽心思能做出干净的片子，但是同
位素，随便做做出的片子都能用
【在 a******n 的大作中提到】
: 新实验室，没有做同位素的许可也没办法。是不是延长谈针的长度会有用？
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a******n
发帖数: 392 | 7 如果是探针不特异，怎么正确选择探针的序列呢？500bp的序列，blast 过human
genome, 确实只有一个对应的位置。是不是还要考虑探针段成小片段后，每一个小片段
的特异性呢？那就太复杂了。
【在 i*********0 的大作中提到】
: 你的probe是从载体里面切的么？
: 我以前做Southern也遇到这样的问题。我的probe也能在marker上产生signal，但是在
: 我的样品上是特异的带。
: 我估计是切下来的探针也带了一点plasimd的序列，和marker有cross reaction。
: 不过你在样品上看到smear带，可能是washing的不彻底，或者探针不特异。
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l**********1
发帖数: 5204 | 8 模板通过PCR获得 then TA sub cloning, then pick up clone do sequencing for
check the probe sequencing or not?
if not how to prove that PCR product as Dig probe without any mutation
if all above steps were done
then might need to PCR about 1kp product as probe
please refer
Primer design
http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
original hint was from
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31807477.html
19th floor post
【在 a******n 的大作中提到】
: 我的probe是用genomic DNA做 模板通过PCR获得的。
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k****l
发帖数: 279 | 9 marker 有信号很正常，probe再特异，跟marker也会结合一点，你想一想marker的copy
number是你的基因组的多少倍
Marker
PCR
【在 a******n 的大作中提到】
: Southern做出来结果是一片smear，看不出条带。有意思的是没有标记的分子量Marker
: 倒是显示出条带来了。最有可能是什么问题？探针的特异性出问题了？我是用DIG PCR
: 标记的500bp的探针。探针电泳条带挺清晰的。
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s******a
发帖数: 472 | 10 非放射性方法确实信噪比差啊
记得哪里看到，说是southern发展了这么多年，虽然各公司如何吹嘘自己的kit，
DIG/AlkPhos等等
还是比不过放射性方法
【在 s******y 的大作中提到】
: 用处不大
: 主要还是由于dig背景信号太大，也就是静噪比的问题
: 这个就的多摸条件了
: 同位素相对来说容易些，我以前做生物素，真的是费尽心思能做出干净的片子，但是同
: 位素，随便做做出的片子都能用
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i*********0
发帖数: 915 | 11 你比对的时候，是不是选择了megablast，你试试另外两个选项试试？
理论上片段越小，结合的非特异性就高。
【在 a******n 的大作中提到】
: 如果是探针不特异，怎么正确选择探针的序列呢？500bp的序列，blast 过human
: genome, 确实只有一个对应的位置。是不是还要考虑探针段成小片段后，每一个小片段
: 的特异性呢？那就太复杂了。
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m******e
发帖数: 459 | 12 如大家讨论的，非同位素探针背景强可能是一个原因，另一个原因可能是基因组DNA除
蛋白不彻底，有nuclease残留，另外也要注意酶切时间和酶的质量，有些酶长时间孵育
会产生星活性。
关于探针，同意lotkaeuler11的看法，先把探针序列克隆到质粒上测序确认是最保险的
办法。只要特异性够好，探针长度应该不是问题，我用过500bp-2k的探针，我还见过有
的paper用200bp探针的。探针杂出marker的条带并不奇怪，我用过的几个探针都是这样
。 |
l**********1
发帖数: 5204 | 13 mark.
【在 m******e 的大作中提到】
: 如大家讨论的，非同位素探针背景强可能是一个原因，另一个原因可能是基因组DNA除
: 蛋白不彻底，有nuclease残留，另外也要注意酶切时间和酶的质量，有些酶长时间孵育
: 会产生星活性。
: 关于探针，同意lotkaeuler11的看法，先把探针序列克隆到质粒上测序确认是最保险的
: 办法。只要特异性够好，探针长度应该不是问题，我用过500bp-2k的探针，我还见过有
: 的paper用200bp探针的。探针杂出marker的条带并不奇怪，我用过的几个探针都是这样
: 。
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a******n
发帖数: 392 | 14 谢谢回复。但我不懂，就算直接PCR产生一两个点突变（毕竟PCR突变率是很低的)，为
什么会影响整体的特异性？如果担心PCR产生突变，那克隆并测序正确后，是不是下一
步也不能用PCR方法产生探针？
【在 l**********1 的大作中提到】
: 模板通过PCR获得 then TA sub cloning, then pick up clone do sequencing for
: check the probe sequencing or not?
: if not how to prove that PCR product as Dig probe without any mutation
: if all above steps were done
: then might need to PCR about 1kp product as probe
: please refer
: Primer design
: http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
: original hint was from
: http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31807477.html
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a******n
发帖数: 392 | 15 懂了。
copy
【在 k****l 的大作中提到】
: marker 有信号很正常，probe再特异，跟marker也会结合一点，你想一想marker的copy
: number是你的基因组的多少倍
:
: Marker
: PCR
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a******n
发帖数: 392 | 16 Nuclease残留是个可能的原因, 但是用southern作筛选克隆的时候，都是用粗提的
genomic DNA的，就是用proteinase K处理过夜，然后异丙醇沉淀。怎么尽量除去
nuclease呢？
【在 m******e 的大作中提到】
: 如大家讨论的，非同位素探针背景强可能是一个原因，另一个原因可能是基因组DNA除
: 蛋白不彻底，有nuclease残留，另外也要注意酶切时间和酶的质量，有些酶长时间孵育
: 会产生星活性。
: 关于探针，同意lotkaeuler11的看法，先把探针序列克隆到质粒上测序确认是最保险的
: 办法。只要特异性够好，探针长度应该不是问题，我用过500bp-2k的探针，我还见过有
: 的paper用200bp探针的。探针杂出marker的条带并不奇怪，我用过的几个探针都是这样
: 。
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l**********1
发帖数: 5204 | 17 if that PCR mutation coincidencely happend on the key ponit or region of the
binding sites between that
probe and Genomic DNA sample, which is simialr to loss of docking site in
Western Blotting , then how can you expect both bind tightly unless p32 or
s35 etc isotope labelling can pick weak binging up but Dig labelling Can't
pick that kind of weak binging.
And after sub cloning that the slected white clone can keep your probe
almost no changed and inserted into that vector with LacZ gene of β-
galactosidase.
http://en.wikipedia.org/wiki/Blue_white_screen
>那克隆并测序正确后，是不是下一
Also, do you think your SB proble could be changed during your diffferent
PCR produced probe and you still can get satisfied result/s by Dig labelling
?!
Btw, it seems that LZ didn't check extracted Genomic DNA sample OD260/OD280
form s/he even worried about if DNA nuclease those proteins still within
that Genomic DNA sample, please refer attaced figure, and it was from one
dutch master degree dissertation: Qiagen genomic DNA Mini Kit (Qiagen cat#
13323)
//www.qiagen.com/Products/Catalog/Sample-Technologies/DNA-Sample-
Technologies/Genomic-DNA/Blood-and-Cell-Culture-DNA-Mini-Kit#
orderinginformation
DNA extraction
Genomic DNA of Pseudomonas fluorescens Pf0-1 wild type strain was extracted
from an overnight culture with the QIAGEN genomic DNA Mini Kit (Qiagen cat#
13323) according to the manufacturer's protocol.
web link:
//www.nioo.knaw.nl/sites/.../DiplomaThesisLoRes.pdf
>>
发信人: androgen (androgen), 信区: Biology
标 题: Re: 请教Southern blot问题
发信站: BBS 未名空间站 (Tue May 21 23:34:22 2013, 美东)
Nuclease残留是个可能的原因, 但是用southern作筛选克隆的时候，都是用粗提的
genomic DNA的，就是用proteinase K处理过夜，然后异丙醇沉淀。怎么尽量除去
nuclease呢？
>
>>> |
m******e
发帖数: 459 | 18 关于基因组DNA抽提纯化，用Qiagen的kit当然得率更高，纯度更高，但成本也高。我对
哺乳动物或者植物基因组提取没有经验，但是从酵母细胞中提取基因组我一般都是手提
，用异丙醇沉淀粗提基因组的上清，用TE溶解沉淀后加RNAse（确保没有DNAse污染）处
理，然后用酚氯仿抽替两次除去RNAse和残留的nuclease，最后加乙醇沉淀后测吸光值
定量。
关于探针克隆后测序，我觉得主要是确保序列是你想要的探针片段，因为不能排除直接
从基因组扩增出来的非特异片段正好跟你的探针大小一样。
关于探针突变的问题，如果你用末端标记法标记探针，PCR引入的点突变可能会有影响
，但是如果你是用切口平移法或者最常用的随机引物标记法，那么影响基本可以忽略。
我只用过随机引物标记地高辛和磷32,用普通taq酶做PCR完全没问题。 |
l**********1
发帖数: 5204 | 19 mark again.
【在 m******e 的大作中提到】
: 关于基因组DNA抽提纯化，用Qiagen的kit当然得率更高，纯度更高，但成本也高。我对
: 哺乳动物或者植物基因组提取没有经验，但是从酵母细胞中提取基因组我一般都是手提
: ，用异丙醇沉淀粗提基因组的上清，用TE溶解沉淀后加RNAse（确保没有DNAse污染）处
: 理，然后用酚氯仿抽替两次除去RNAse和残留的nuclease，最后加乙醇沉淀后测吸光值
: 定量。
: 关于探针克隆后测序，我觉得主要是确保序列是你想要的探针片段，因为不能排除直接
: 从基因组扩增出来的非特异片段正好跟你的探针大小一样。
: 关于探针突变的问题，如果你用末端标记法标记探针，PCR引入的点突变可能会有影响
: ，但是如果你是用切口平移法或者最常用的随机引物标记法，那么影响基本可以忽略。
: 我只用过随机引物标记地高辛和磷32,用普通taq酶做PCR完全没问题。
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