C******2
发帖数: 97 | 1 求助各位，最近我在操作一个逆转录病毒载体，在两个ltr 之间插入了大概 4kb 的片
断 ，两个ltr呈反向排列，但是之间只有20bp的间隔，具体情况见下图，但是最终不能
正常产生病毒，请教各位有什么好的建议么，或者说这样的载体本身就不能正常工作？
谢谢大家的建议。 |
C******2
发帖数: 97 | |
C******2
发帖数: 97 | |
B******o
发帖数: 496 | 4 你的载体是啥？具体说说两个LTR之间的序列，通常会有些包装蛋白的element。
另外，4kb算是比较大得了，病毒的产量会随insert 长度有指数的下降
【在 C******2 的大作中提到】
: 求助各位，最近我在操作一个逆转录病毒载体，在两个ltr 之间插入了大概 4kb 的片
: 断 ，两个ltr呈反向排列，但是之间只有20bp的间隔，具体情况见下图，但是最终不能
: 正常产生病毒，请教各位有什么好的建议么，或者说这样的载体本身就不能正常工作？
: 谢谢大家的建议。
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C******2
发帖数: 97 | 5 谢谢。
两个ｌｔｒ 之间就只有包装序列了（ｐｋｓ)，包装序列和５ｌｔｒ连在一起，他们
和３ＬＴＲ 之间只有２０ｂｐ 左右的间隔，我发现感染效率极低，难道说就是因为
插入的片度太大了，我是想做ｒｅｓｃｕｅ的，所以放了ｏｒｉ, ｓｅｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｍａｒｋｅｒ 等等一大堆东西在里面 。
5'和３‘之间的间隔有要求么？２０ｂｐ 是不是不能ｗｏｒｋ? |
C******2
发帖数: 97 | 6 谢谢。
两个ｌｔｒ 之间就只有包装序列了（ｐｋｓ)，包装序列和５ｌｔｒ连在一起，他们
和３ＬＴＲ 之间只有２０ｂｐ 左右的间隔，我发现感染效率极低，难道说就是因为
插入的片度太大了，我是想做ｒｅｓｃｕｅ的，所以放了ｏｒｉ, ｓｅｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｍａｒｋｅｒ 等等一大堆东西在里面 。
5'和３‘之间的间隔有要求么？２０ｂｐ 是不是不能ｗｏｒｋ?
【在 B******o 的大作中提到】
: 你的载体是啥？具体说说两个LTR之间的序列，通常会有些包装蛋白的element。
: 另外，4kb算是比较大得了，病毒的产量会随insert 长度有指数的下降
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B******o
发帖数: 496 | 7 Can you please send me the orginal website you get the plasmid? I need to
look at the details of the vector. 20bp is very bizarre. Most of the vectors
(if not all) I used in the before had much longer sequences.
【在 C******2 的大作中提到】
: 谢谢。
: 两个ｌｔｒ 之间就只有包装序列了（ｐｋｓ)，包装序列和５ｌｔｒ连在一起，他们
: 和３ＬＴＲ 之间只有２０ｂｐ 左右的间隔，我发现感染效率极低，难道说就是因为
: 插入的片度太大了，我是想做ｒｅｓｃｕｅ的，所以放了ｏｒｉ, ｓｅｌｅｃｔｉｏ
: ｎ ｍａｒｋｅｒ 等等一大堆东西在里面 。
: 5'和３‘之间的间隔有要求么？２０ｂｐ 是不是不能ｗｏｒｋ?
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C******2
发帖数: 97 | 8
vectors
The construction is modified and derived from pRetrosuper which is used for
random mutation in host genome based on gene-trap. Truncated 3’LTR
fragment is promoter activaty lost. The idea is host genome will be mutated
by insertion because the existence of splicing acceptor(SA) fragment thus
generate a fusion RNA containing cherry CDS. Fusion florescence protein can
be detected in some case when insertion occurs as an in frame manner. The
insertion will also make the infected cells be G418 resistant which can be
use to enrich those infected the cells by screening. Finally, in theory,
insertion fragment can be recovered by plasmids rescue strategy(In brief,
restriction digestion then ligation) depending on the PUCori and Kanamycin
expression cassette. I think this system does work since I found several
cells with red florescence and I detected 5’LTR fragment by PCR when using
genome DNA of infected cells as template. The question is after G418
screening, the number of surviving clones is extremely low which showed a
very low infection efficiency.
【在 B******o 的大作中提到】
: Can you please send me the orginal website you get the plasmid? I need to
: look at the details of the vector. 20bp is very bizarre. Most of the vectors
: (if not all) I used in the before had much longer sequences.
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C******2
发帖数: 97 | 9 我猜想，只是猜想可能是两个ＬＴＲ 之间的插入片断太大，导致了病毒产率和感染效
率较低，另外由于两个ＬＴＲ 另一端基本上直接被连接在了一起，只有几个酶切位点
相隔，是不是这对病毒有不好的影响，因为在一般情况下，ＬＴＲ另一端是被载体的骨
架隔开的，但是我这里把载体骨架也包装进入病毒了。 你有什么建议么？再次感谢
。 |
b********s
发帖数: 9 | 10 怎么觉得3LTR的方向放反了？
如果3LTR没有问题的话，有可能是细菌的ori的作用。 |
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C******2
发帖数: 97 | 11 能具体说说么?我接触这个时间不长，没什么经验，谢谢。
【在 b********s 的大作中提到】
: 怎么觉得3LTR的方向放反了？
: 如果3LTR没有问题的话，有可能是细菌的ori的作用。
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b********s
发帖数: 9 | 12 记得以前看到过文章中说细菌ori整合到真核染色体上会导致染色体不稳定而丢失。再
具体就不知道了，我也不是做这行的，仅仅提供一个思路而已。 |
C******2
发帖数: 97 | 13 谢谢你。
【在 b********s 的大作中提到】
: 记得以前看到过文章中说细菌ori整合到真核染色体上会导致染色体不稳定而丢失。再
: 具体就不知道了，我也不是做这行的，仅仅提供一个思路而已。
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S*********s
发帖数: 304 | 14 你如果要做rescue,没有必要就纠结于这个载体。
换个retrovirus or lentivirus expression vector.
【在 C******2 的大作中提到】
: 谢谢你。
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C******2
发帖数: 97 | 15 不只是ｒｅｓｃｕｅ,首先要能突变ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ,其次要能筛选ｉｎｆｅｃｔ
ｅｄ ｃｅｌｌｓ. |
B******o
发帖数: 496 | 16 The vector does look weird. First, what is the promoter for the viral
expression. Usually, if it is MMLV, then the promoter is contained in 5'LTR,
so the viral genome is transcribed from there. Otherwise, people will put a
CMV in front of 5'LTR to express it. Without a promoter, the viral genome
will not be expressed and packaged into virus particles.
Second, I never saw anybody inserted Ori within a viral genome. It is very
weired. Not sure how it will affect your gene expression.
Third, poly A tail is usually added after 3'LTR. Again, your vector design
is weird.
Fourth, what is your packaging system? Ecotropic or Amphrotropic? They will
generate viruses with different infectivity toward mamalian cells.
for
mutated
can
【在 C******2 的大作中提到】
: 不只是ｒｅｓｃｕｅ,首先要能突变ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ,其次要能筛选ｉｎｆｅｃｔ
: ｅｄ ｃｅｌｌｓ.
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