a**********2 发帖数: 28 | 1 转行新人,跑来向牛人们请教一下~
我最近要做一个semi-quantitative western blot
Nitrocellulose membrane, chemiluminescent staining
用GAPDH来normalization
于是,会有两种不同的antibody,一种测我的target,另一种stain GAPDH.
在网上查了一晚上,还是搞不清哪种方式更好:
1)strip之后在同一张上stain;
2) 跑两张同样的膜分别stain;
如果1)效果好些,有什么strip buffer推荐吗?
如果2)好些,有什么需要特别注意事项?比如转膜时如何保证效率基本一致?
另外,综合而言,为了确保最终结果的有效性,除了对loading sample做个gradient之
外,还有什么其它建议吗?
完全转行新人,问题很弱,还请大家不要鄙视俺。。。
拜谢! |
h*******o 发帖数: 4884 | 2 你的蛋白的分子量如果和gapdh 差距比较大 (当然前提是抗体也不能太垃圾)
strip比较好
用mild一点的strip, 然后重新block, 做gapdh |
g*********5 发帖数: 2533 | 3 2 is no good because no a same experiment.
【在 a**********2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 转行新人,跑来向牛人们请教一下~ : 我最近要做一个semi-quantitative western blot : Nitrocellulose membrane, chemiluminescent staining : 用GAPDH来normalization : 于是,会有两种不同的antibody,一种测我的target,另一种stain GAPDH. : 在网上查了一晚上,还是搞不清哪种方式更好: : 1)strip之后在同一张上stain; : 2) 跑两张同样的膜分别stain; : 如果1)效果好些,有什么strip buffer推荐吗? : 如果2)好些,有什么需要特别注意事项?比如转膜时如何保证效率基本一致?
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e****s 发帖数: 1125 | 4 如果Size差别挺大的话,最好就是一个膜,减开,分别加一抗。
【在 a**********2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 转行新人,跑来向牛人们请教一下~ : 我最近要做一个semi-quantitative western blot : Nitrocellulose membrane, chemiluminescent staining : 用GAPDH来normalization : 于是,会有两种不同的antibody,一种测我的target,另一种stain GAPDH. : 在网上查了一晚上,还是搞不清哪种方式更好: : 1)strip之后在同一张上stain; : 2) 跑两张同样的膜分别stain; : 如果1)效果好些,有什么strip buffer推荐吗? : 如果2)好些,有什么需要特别注意事项?比如转膜时如何保证效率基本一致?
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n***w 发帖数: 2405 | 5 如果不是同一个species的,都可以直接在同一张膜上弄,没有必要strip,也没有必要
跑两张膜。 |
a**********2 发帖数: 28 | 6 谢谢大家的回复!
-- 很可惜,protein size差别很小,应该是剪不开的。。。
-- strip的话,有个overexpress的condition,担心可能去不干净;不知有没有什么
strip kit推荐?
-- species倒是不同的,一个anti-mouse, 一个anti-rabbit。同时stain两种antibody
,不会有cross-talk吗? |
s******s 发帖数: 13035 | 7 你的蛋白表达量高的话,cross-talk问题不大
antibody
【在 a**********2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢大家的回复! : -- 很可惜,protein size差别很小,应该是剪不开的。。。 : -- strip的话,有个overexpress的condition,担心可能去不干净;不知有没有什么 : strip kit推荐? : -- species倒是不同的,一个anti-mouse, 一个anti-rabbit。同时stain两种antibody : ,不会有cross-talk吗?
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a**********2 发帖数: 28 | 8 谢谢大家的回复!
-- 很可惜,protein size差别很小,应该是剪不开的。。。
-- strip的话,有个overexpress的condition,担心可能去不干净;不知有没有什么
strip kit推荐?
-- species倒是不同的,一个anti-mouse, 一个anti-rabbit。同时stain两种antibody
,不会有cross-talk吗? |
a**********2 发帖数: 28 | 9 多谢各位!
明后天跑胶,大后天再上来汇报心得〜:) |
l*******u 发帖数: 79 | 10 用荧光二抗,同时染,不用担心交叉反应,也不用担心蛋白被洗掉,而且定量也更准一些
antibody
【在 a**********2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢大家的回复! : -- 很可惜,protein size差别很小,应该是剪不开的。。。 : -- strip的话,有个overexpress的condition,担心可能去不干净;不知有没有什么 : strip kit推荐? : -- species倒是不同的,一个anti-mouse, 一个anti-rabbit。同时stain两种antibody : ,不会有cross-talk吗?
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y****i 发帖数: 2194 | 11 thermo的restore buffer
担心去不干净的话,可以strip完了拿去曝光一次,确定了原来的band不在了再上下一
个antibody
antibody
【在 a**********2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢大家的回复! : -- 很可惜,protein size差别很小,应该是剪不开的。。。 : -- strip的话,有个overexpress的condition,担心可能去不干净;不知有没有什么 : strip kit推荐? : -- species倒是不同的,一个anti-mouse, 一个anti-rabbit。同时stain两种antibody : ,不会有cross-talk吗?
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C**S 发帖数: 522 | 12 之前试过几种stripping buffer,没发现好用的。现在我都是先染一个弱的蛋白,比如
曝光需要30秒的。之后不做stripping,接着染强的,比如1秒就可以的。 |
q******g 发帖数: 3858 | 13 我也是这样。如果两个蛋白分子量差不多,就换个loading control. GAPDH 37Kd,
TUBULIN50Kd, 差别还是够大。
如果做phosphorylated protein, 我还是建议strip。
【在 C**S 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 之前试过几种stripping buffer,没发现好用的。现在我都是先染一个弱的蛋白,比如 : 曝光需要30秒的。之后不做stripping,接着染强的,比如1秒就可以的。
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l***y 发帖数: 4671 | 14 2nd this
一些
【在 l*******u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用荧光二抗,同时染,不用担心交叉反应,也不用担心蛋白被洗掉,而且定量也更准一些 : : antibody
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l***y 发帖数: 4671 | 15 also 2nd this。这就是用不同的 dynamic ranges 来区分。具体的计算是:比如说,
要看的 protein 需要 5min 曝光,而 house keeping protein 只需要 5S,就可以不
用 stripping 了。最糟的情况下由这种方法带来的误差也不太可能会超过 1/60 也就
是 1.7% (除非 GAPDH 上的 non-specific binding 比 target protein 还要强 --
那也是可以估算的)。而对于 WB,只要方法带来的误差不超过 5%,就可以忽略之。想
要更精确的结果,只需要调节一抗的浓度来加大弱信号和强信号的信号比就可以。
【在 C**S 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 之前试过几种stripping buffer,没发现好用的。现在我都是先染一个弱的蛋白,比如 : 曝光需要30秒的。之后不做stripping,接着染强的,比如1秒就可以的。
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a**********2 发帖数: 28 | 16 感谢大家的建议!
附上胶图,回馈本版:)
最终,我选择用同一张胶staining,并且不做strip
为了确认没有cross-talk,弃用chemi,改用fluorescent:
1) 一张胶,同时用anti-ms goat 和 anti-rb goat 做primary antibody staining;
2) 再同时用 anti-rb donkey Alexa647 和 anti-ms donkey Alexa488 做secondary
antibody staining;
3) 如gel image所示,用473nm激发时,我只看到anti-ms所对应的protein,而用635nm
激发时,只看到anti-rb对应的protein:)
初步实验算是成功〜
再次谢谢大家! |