a**********2
发帖数: 28 | 1 转行新人，跑来向牛人们请教一下~
我最近要做一个semi-quantitative western blot
Nitrocellulose membrane, chemiluminescent staining
用GAPDH来normalization
于是，会有两种不同的antibody，一种测我的target，另一种stain GAPDH.
在网上查了一晚上，还是搞不清哪种方式更好:
1）strip之后在同一张上stain；
2) 跑两张同样的膜分别stain；
如果1)效果好些，有什么strip buffer推荐吗？
如果2)好些，有什么需要特别注意事项？比如转膜时如何保证效率基本一致？
另外，综合而言，为了确保最终结果的有效性，除了对loading sample做个gradient之
外，还有什么其它建议吗？
完全转行新人，问题很弱，还请大家不要鄙视俺。。。
拜谢！ |
h*******o
发帖数: 4884 | 2 你的蛋白的分子量如果和gapdh 差距比较大 （当然前提是抗体也不能太垃圾）
strip比较好
用mild一点的strip， 然后重新block， 做gapdh |
g*********5
发帖数: 2533 | 3 2 is no good because no a same experiment.
【在 a**********2 的大作中提到】
: 转行新人，跑来向牛人们请教一下~
: 我最近要做一个semi-quantitative western blot
: Nitrocellulose membrane, chemiluminescent staining
: 用GAPDH来normalization
: 于是，会有两种不同的antibody，一种测我的target，另一种stain GAPDH.
: 在网上查了一晚上，还是搞不清哪种方式更好:
: 1）strip之后在同一张上stain；
: 2) 跑两张同样的膜分别stain；
: 如果1)效果好些，有什么strip buffer推荐吗？
: 如果2)好些，有什么需要特别注意事项？比如转膜时如何保证效率基本一致？
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e****s
发帖数: 1125 | 4 如果Size差别挺大的话，最好就是一个膜，减开，分别加一抗。
【在 a**********2 的大作中提到】
: 转行新人，跑来向牛人们请教一下~
: 我最近要做一个semi-quantitative western blot
: Nitrocellulose membrane, chemiluminescent staining
: 用GAPDH来normalization
: 于是，会有两种不同的antibody，一种测我的target，另一种stain GAPDH.
: 在网上查了一晚上，还是搞不清哪种方式更好:
: 1）strip之后在同一张上stain；
: 2) 跑两张同样的膜分别stain；
: 如果1)效果好些，有什么strip buffer推荐吗？
: 如果2)好些，有什么需要特别注意事项？比如转膜时如何保证效率基本一致？
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n***w
发帖数: 2405 | 5 如果不是同一个species的，都可以直接在同一张膜上弄，没有必要strip，也没有必要
跑两张膜。 |
a**********2
发帖数: 28 | 6 谢谢大家的回复！
-- 很可惜，protein size差别很小，应该是剪不开的。。。
-- strip的话，有个overexpress的condition，担心可能去不干净；不知有没有什么
strip kit推荐？
-- species倒是不同的，一个anti-mouse, 一个anti-rabbit。同时stain两种antibody
，不会有cross-talk吗？ |
s******s
发帖数: 13035 | 7 你的蛋白表达量高的话，cross-talk问题不大
antibody
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢大家的回复！
: -- 很可惜，protein size差别很小，应该是剪不开的。。。
: -- strip的话，有个overexpress的condition，担心可能去不干净；不知有没有什么
: strip kit推荐？
: -- species倒是不同的，一个anti-mouse, 一个anti-rabbit。同时stain两种antibody
: ，不会有cross-talk吗？
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a**********2
发帖数: 28 | 8 谢谢大家的回复！
-- 很可惜，protein size差别很小，应该是剪不开的。。。
-- strip的话，有个overexpress的condition，担心可能去不干净；不知有没有什么
strip kit推荐？
-- species倒是不同的，一个anti-mouse, 一个anti-rabbit。同时stain两种antibody
，不会有cross-talk吗？ |
a**********2
发帖数: 28 | 9 多谢各位！
明后天跑胶，大后天再上来汇报心得〜:) |
l*******u
发帖数: 79 | 10 用荧光二抗，同时染，不用担心交叉反应，也不用担心蛋白被洗掉，而且定量也更准一些
antibody
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢大家的回复！
: -- 很可惜，protein size差别很小，应该是剪不开的。。。
: -- strip的话，有个overexpress的condition，担心可能去不干净；不知有没有什么
: strip kit推荐？
: -- species倒是不同的，一个anti-mouse, 一个anti-rabbit。同时stain两种antibody
: ，不会有cross-talk吗？
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y****i
发帖数: 2194 | 11 thermo的restore buffer
担心去不干净的话，可以strip完了拿去曝光一次，确定了原来的band不在了再上下一
个antibody
antibody
【在 a**********2 的大作中提到】
: 谢谢大家的回复！
: -- 很可惜，protein size差别很小，应该是剪不开的。。。
: -- strip的话，有个overexpress的condition，担心可能去不干净；不知有没有什么
: strip kit推荐？
: -- species倒是不同的，一个anti-mouse, 一个anti-rabbit。同时stain两种antibody
: ，不会有cross-talk吗？
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C**S
发帖数: 522 | 12 之前试过几种stripping buffer，没发现好用的。现在我都是先染一个弱的蛋白，比如
曝光需要30秒的。之后不做stripping，接着染强的，比如1秒就可以的。 |
q******g
发帖数: 3858 | 13 我也是这样。如果两个蛋白分子量差不多，就换个loading control. GAPDH 37Kd,
TUBULIN50Kd, 差别还是够大。
如果做phosphorylated protein, 我还是建议strip。
【在 C**S 的大作中提到】
: 之前试过几种stripping buffer，没发现好用的。现在我都是先染一个弱的蛋白，比如
: 曝光需要30秒的。之后不做stripping，接着染强的，比如1秒就可以的。
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l***y
发帖数: 4671 | 14 2nd this
一些
【在 l*******u 的大作中提到】
: 用荧光二抗，同时染，不用担心交叉反应，也不用担心蛋白被洗掉，而且定量也更准一些
:
: antibody
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l***y
发帖数: 4671 | 15 also 2nd this。这就是用不同的 dynamic ranges 来区分。具体的计算是：比如说，
要看的 protein 需要 5min 曝光，而 house keeping protein 只需要 5S，就可以不
用 stripping 了。最糟的情况下由这种方法带来的误差也不太可能会超过 1/60 也就
是 1.7% （除非 GAPDH 上的 non-specific binding 比 target protein 还要强 --
那也是可以估算的）。而对于 WB，只要方法带来的误差不超过 5%，就可以忽略之。想
要更精确的结果，只需要调节一抗的浓度来加大弱信号和强信号的信号比就可以。
【在 C**S 的大作中提到】
: 之前试过几种stripping buffer，没发现好用的。现在我都是先染一个弱的蛋白，比如
: 曝光需要30秒的。之后不做stripping，接着染强的，比如1秒就可以的。
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a**********2
发帖数: 28 | 16 感谢大家的建议！
附上胶图，回馈本版：）
最终，我选择用同一张胶staining，并且不做strip
为了确认没有cross-talk，弃用chemi，改用fluorescent:
1) 一张胶，同时用anti-ms goat 和 anti-rb goat 做primary antibody staining;
2) 再同时用 anti-rb donkey Alexa647 和 anti-ms donkey Alexa488 做secondary
antibody staining;
3) 如gel image所示，用473nm激发时，我只看到anti-ms所对应的protein,而用635nm
激发时，只看到anti-rb对应的protein:)
初步实验算是成功〜
再次谢谢大家！ |
