n******d
发帖数: 1055 | 1 most journal will accept data without GAPDH loading control. if you can't
load equally, then you are not for this kind of research.
western GAPDH? a total waste of time. |
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N***P
发帖数: 153 | 2 最近做western blot，肌肉里面的GAPDH都是两条平行的带，中间间隔1毫米。
有人见到过这种情况吗？ |
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N***P
发帖数: 153 | 3 不是加样不一致，而是每条骨骼肌的lane都用两条带。如果把这两条带合并，每条lane
的总density是一样的。
能否解释一下为什么western gapdh 是 waste of time? |
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W*********n
发帖数: 775 | 4 想找一个Anopheles的GAPDH 抗体用。大家有没有用过的，推荐一下？
谢谢！ |
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l**********t
发帖数: 138 | 5 RNA标本来源于体外培养的人骨髓基质细胞，发现有人用荧光定量PCR做出这样的结果，
靶基因在32左右，GAPDH在30-32之间，这实验结果还可靠不？ |
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d********0
发帖数: 534 | 6 晕，GAPDH应该比belta-actin还稳定吧，怎么可能这么少，我们老板说过，大于30的
gene要么是不表达，要么是有问题，因为就是一点样品都不加，也可能跑出30，大于30
就与机器误差很难鉴别了 |
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l**********t
发帖数: 138 | 7 如何把GAPDH的Ct值做到30以上，有可能吗？ |
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l**********t
发帖数: 138 | 8 大家一般检测到GAPDH的Ct值是多少呢？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.2.2 |
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p*****a
发帖数: 3634 | 9 什么可靠不可靠，都是骗人玩的，差不多了就出图发文章，有什么可多想的。
不过，这个GAPDH的 Ct都在30以上，是不是cdna浓度太太低了？ |
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d*******s
发帖数: 61 | 10 看过该网站回复人的帖子后，发现原来造假问题是异常严重的：WB里面，GAPDH的一张
图片被反复用在多个图中；而且在他们后来发表的其它 8 篇论文中，还存在相同的问
题！这是很明显的蓄意作假了。这些论文在下面用黑体标明：
7 Responses:
Well that was easy….In the v282#17p12363 paper, look at the GAPDH bands in
Figure 3A. Now go back to Figure 2C and look at the GAPDH bands. Lanes 4-5-6
are the same. They duplicated the blot.In the v283#29p20045 paper, Fig 3A
right panel GAPDH blot contains the same 2 bands as Fig. 5D.So, the “
mistake” appears to involve using the same GAPDH blot for different
experiments. ... 阅读全帖 |
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c******r
发帖数: 3778 | 11 应该可以做multiplex reaction
GAPDH是可以做所谓的internal control的。就是说，在同一个pcr中，同时run两个甚
至两个targets，其中一个是control，另外一个是要测的基因。
这个internal control的目的有两个，一个是quality control，就是保证这个
reaction没有忘掉任何东西，没有加错任何东西等等。另外一个目的是loading
control，assumption就是两个sample中的GAPDH是不变的，换句话说，要测量的是在同
样量的GAPDH下，要测的基因在处理前和处理后有无变化。
为了达到这个目的，最好是run multiplex。这样才能保证测到的GAPDH和G之间是来自
确定的同一个loading量。
另外一个run multiplex的原因是统计的原因。如果分开run GAPDH和G，那么
triplicate之后会得到三个G的量，和三个GAPDH的量，而这六个量之间没有一一对应的
关系。就是说不能用G1/GAPDH1，G2/GAPDH2。。。。而只能用G的平均值/GAPDH的平均
值。但是... 阅读全帖 |
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b******n
发帖数: 4225 | 12 1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好
抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是... 阅读全帖 |
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i****g
发帖数: 3896 | 13 写得比较有意思，但是不太实用，可能实验条件相差太大。precast gel比自己制的gel
效果要好很多，结果也容易重复。antibody要看运气的，呵呵。
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗
体质量可以，但是选用 Santa的单抗还是有风险，估计这... 阅读全帖 |
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w********h
发帖数: 12367 | 14 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: bulletin (bulletin), 信区: Biology
标 题: 穷人的劳斯莱斯——五年western经验谈（转）
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 2 23:29:05 2012, 美东)
1. 抗体的选择
对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很
简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区
的实验者而言，感触尤深。在 这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗
体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），
而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的 价最贵；比较有性价比的是CST的
抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没
有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是
通常量比100微升多出来10... 阅读全帖 |
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A***g
发帖数: 191 | 15 所在的实验室是一个烧钱的实验室，做几十个转录因子，实验套路大致就是qPCR和
western结合检测不同基因在不同human cell line中的表达，然后挑出表达合适的细胞
系去做siRNA和Chip-seq，目的呢，找出这些转录因子的binding site以及pathway什么
的。
我其实只是一国内小硕在这里做一小技术员，可是目前实验室没有post-doc，所以这些
实验基本上就着落在我和另一技术员身上，她负责做siRNA，其它的实验都我做。
照着protocol做实验当然没问题啊，遇到不懂的没人问就难办了。可是我成天闷头赶实
验，哪里有空看文献呢，所以就只好跟science脱节了。
做qPCR还好说（其实也有困难，另行发帖请教），我用的是GAPDH作为internal
control来计算相对表达量。可是做western时，我一开始选的是GAPDH做内对照，买的
是Sigma的抗体，做的还挺好的，因为这个GAPDH检测大小是36kd，正好跟我的目的蛋白
50-75kd能分开，我转一张膜，然后剪开就可以同时检测两个抗体。可是老板在我上周
汇报结果时说GAPDH主要在细胞质表达 |
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o****t
发帖数: 242 | 16 我用了GAPDH两段序列作为 housekeeping gene endogenous control，去检测一个
gene的表达正常还是deletion，结果出来一个正常一个deletion。
用的是 ΔΔCt的方法，Ct平均值都在21,22左右。
我之前一直用的是一对GAPDH primer，这次做的时候想test一下第二对primer。出现这
个结果不同的情况之后，我又用第二对GAPDH primer去检测了之前我做的其他case（用
第一对GAPDH primer作为endogenous control）比较表达的不同的，结果都和之前的结
果一致。
请教各位高手，如果你们碰到这样的问题，怎么解决呢？多谢。 |
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s******r
发帖数: 2876 | 17 Histon H1 行不行？
所在的实验室是一个烧钱的实验室，做几十个转录因子，实验套路大致就是qPCR和
western结合检测不同基因在不同human cell line中的表达，然后挑出表达合适的细胞
系去做siRNA和Chip-seq，目的呢，找出这些转录因子的binding site以及pathway什么
的。
我其实只是一国内小硕在这里做一小技术员，可是目前实验室没有post-doc，所以这些
实验基本上就着落在我和另一技术员身上，她负责做siRNA，其它的实验都我做。
照着protocol做实验当然没问题啊，遇到不懂的没人问就难办了。可是我成天闷头赶实
验，哪里有空看文献呢，所以就只好跟science脱节了。
做qPCR还好说（其实也有困难，另行发帖请教），我用的是GAPDH作为internal
control来计算相对表达量。可是做western时，我一开始选的是GAPDH做内对照，买的
是Sigma的抗体，做的还挺好的，因为这个GAPDH检测大小是36kd，正好跟我的目的蛋白
50-75kd能分开，我转一张膜，然后剪开就可以同时检测两个抗体。可是老板在我上周
汇报结 |
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h********n
发帖数: 4079 | 18 我的做法是: 直接用这个基因是actin的倍数来做图, x轴是不同细胞或者同意细胞里不同基因.
2^(Ct of actin - Ct of gene x), 用raw data做图. 我们用这个方法投稿发表, 没啥问题.
另外, 我建议actin可能比gapdh更好, 在cancer里面, gapdh变化也不小. |
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j*******8
发帖数: 933 | 19 LDH or GAPDH, but about 5% GAPDH can also translocate to nuclear under some
circumstances. |
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t*****t
发帖数: 773 | 20 阅读生物文献时 ，发现做口腔细胞基因表达的研究时 ，几乎不用GAPDH做内参。这个
是为什么？ 难道buccal cell中GAPDH不表达？ |
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l****b
发帖数: 400 | 21 GAPDH is a glycolysis enzyme and is regulated by many things. In another
words, it is an awful control. Tubulin is better. HSP90 is also good. both
have good antibodies.
But disappearing actin is interesting. worth looking after, don't you think?
Actin
GAPDH, |
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m***o
发帖数: 272 | 22 其实很多文献谈qPCR内参的。可以google一下。这里说一下我的体会。18sRNA 做内参
的一个确定是他不是mRNA,另外他的ct太小。但是有时他还是比较准确。比如我做不同
老鼠的脂肪组织就比较好。而且有片文献专门比较了脂肪组织不同的几个内参，发现
18RNA是最好的一个，而且 在dilute很多的cDNA里，发现变化也不是很大。
不过，我只是在找不到别的mRNA内参时用18sRNA.楼上说用GAPDH，actin，做内参，实
际GAPDH 不是个好的内参，很多时候会变化。我推荐用rpt18.不过再做自己样品时，是
要比较一下不同的内参的。搜搜版上，这个问题好像讨论过。 |
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a**********2
发帖数: 28 | 23 转行新人，跑来向牛人们请教一下~
我最近要做一个semi-quantitative western blot
Nitrocellulose membrane, chemiluminescent staining
用GAPDH来normalization
于是，会有两种不同的antibody，一种测我的target，另一种stain GAPDH.
在网上查了一晚上，还是搞不清哪种方式更好:
1）strip之后在同一张上stain；
2) 跑两张同样的膜分别stain；
如果1)效果好些，有什么strip buffer推荐吗？
如果2)好些，有什么需要特别注意事项？比如转膜时如何保证效率基本一致？
另外，综合而言，为了确保最终结果的有效性，除了对loading sample做个gradient之
外，还有什么其它建议吗？
完全转行新人，问题很弱，还请大家不要鄙视俺。。。
拜谢！ |
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h*******o
发帖数: 4884 | 24 你的蛋白的分子量如果和gapdh 差距比较大 （当然前提是抗体也不能太垃圾）
strip比较好
用mild一点的strip， 然后重新block， 做gapdh |
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g******r
发帖数: 139 | 25 OK,what you mean is the cDNA concentration used should be in the linear
region of the reaction.
This concentration would vary for each of the genes, dependent on the
abundance. I did not perform such cDNA dilution pilot experiment for each
gene. I just used 2-4 ng cDNA in the real-time PCR. One would assume the
gene with Ct of 25-31 is within the linear range, if the Ct is >33, it is
possible the cDNA conc is kind of out the range.
And it is true as Isaid that I got no outlier replicates for gen... 阅读全帖 |
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s********3
发帖数: 231 | 26 《科学》对STAP手稿的专家评审意见曝光
《科学》对传说中的STAP细胞论文的三名评审专家意见，过去一直被雪藏，今天终于
被曝光。专家对这一研究的评价不高，认为非常全面的描述性研究，如果结果确定，可
能导致发育生物学大厦的颠覆，其实是不相信这种研究结论。因为没有当时的投稿件，
所以没有办法对这些评价进行更深入分析。不过这些资料显然都在某个地方，只是拥有
的人不愿意拿出来。
Retraction Watch readers are of course familiarwith the STAP stem cell saga,
which was punctuated by tragedy last month whenone of the authors of the
two now-retracted papers in Nature committed suicide.
In June, Science‘s news section reported:
Sources in the scientific community confirm that early version... 阅读全帖 |
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C****7
发帖数: 270 | 28 我想卖的物品:
Bovine Pit. Extract (BPE)
Anastrozole
Charcoal/Dextran Treated Fetal Bovine Serum
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (4.5 g⁄L D-
glucose)
RPMI Medium 1640 (1X), liquid.Contains L-glutamine, but no phenol red.
GAPDH siRNA
X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent
Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium
可接受价格(必须明码标价！):
Up to 60% off original price
物品新旧要求:
邮寄方式要求:
You chose you pay
买卖双方谁承担邮寄损失(Required if not code only):
Before mail on me
After mail on you
付款方式说明: |
|
M****e
发帖数: 70 | 29 my point is to make sure that you have transfer of good
quality and quantity of RNA onto the blotting material.
the washing stringency for your experiment is not quite
high (i.e., 42C). i think the problem is mainly due to
bad RNA or probe. if there is a lot of radioactive
nucleotides incorporated into the probe, you should
detect very hot signal after purification. denature the
probe before use. GAPDH is a housekeeping gene that is
typically used for normalization of load. i suggest you
read a |
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f*****a
发帖数: 7 | 30 I only use SYBR. What I did is
1. Use Primer Express 1.5 or 2.0 from ABI to design primers. Follow their
guidelines. Or just use Primer3.
2. Use Amply 1.2 (or higher) and Netprimer http://www.premierbiosoft.com/n
etprimer/) to evaluate candidates.
3. Blast your primers.
4. Pick up 2-3 pairs. Do standard and dissociation curves. Chose the one wor
k best.
Make sure to chose the right normalization primers for your experiment. 18S,
actin, GAPDH, tubulin... |
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d******r
发帖数: 124 | 31 非常谢谢
再问一句：一般用什么做internal control？ actin？GAPDH？ 还是S18 rRNA？ |
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A******y
发帖数: 2041 | 32 If you are using one-step, Quanta Biosciences kits are the best. I have
used all major brands (new Bio-rad, Applied Bio, Invitrogen, etc). Quanta
is the OEM for Bio-rad for long time. You also want to make sure that you
have two housekeeping genes and normalize your mRNA (cDNA) loads as a third
control. I like GAPDH and S18 rRNA. |
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A***g
发帖数: 191 | 33 做了二十多个基因在十几个不同的人的细胞系中的表达量实验。
用的是qPCR方法。我的做法是，以cDNA为模板，以GAPDH为internal control，做看家
基因的模板多稀释20倍。
结果分析呢，我用的是 2-△△CT Method，设定某个基因在某个细胞系中的表达量为1
（这个细胞系也就是我设定的对照），那该基因在不同细胞系中的表达量就都是相对这
个细胞系而言，这样得出来的结果是relative expression level.
可是老板要的结果是最好能一目了然能看清不同基因在同一细胞系中的表达量变化，同
时也能兼顾在其它细胞系中的表达量变化。她说我给她的结果很容易让人误解。因为每
个基因都有一个细胞系为1，看上去好像这两个基因表达量一样似的。
我用的这个公式应该不能够比较不同基因的表达量吧？
同时我为了结果好看，基本上都是选择表达量比较低的细胞系为1，这样有的表达量高
的数值就很大，我老板就以为这个数字这么打是不是表达量很高很高啊？
我家老板要达到的这个目的要怎么分析呢？有没有相关文献啊？ |
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f*********r
发帖数: 1233 | 34 不光是二抗价格的问题。更重要的是，省去了底物反应时间，省去了暗室底片曝光的麻
烦。而且，荧光持久，几个月之后重新扫描仍然清晰。
再有，二抗可以配不同颜色（波长）的荧光。这样一来，同一分子量的两种蛋白可以一
次incubate和成像。例如，需要染磷酸化x蛋白（p-x）和总x蛋白（t-x）。p-x一抗是
mouse的，配上anti-mouse 680（波长）二抗，扫出来是红色；t-x一抗是rabbit的，配
上anti-rabbit 800的二抗，绿色。一张膜就搞定了。定量是，两种颜色互不影响。算p
-x/t-x比值的时候，也不用拿GAPDH或者beta-actin来normalize。 |
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a***e
发帖数: 1010 | 35 in these cases, both HA and IgG are background controls. Theoretically,
both of them should have no pulldown signals at all (= 0). If you divide
something by HA or IgG signal, any little variation will change your ratio
dramatically. So, neither of them is the right normalization.
A good normalization method is using 1% input as a control.
However, the best normalization is using some internal controls that are not
changed by your treatment. For example, your TF binds gene GAPDH and gene
X. |
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E*******2
发帖数: 131 | 36 我正在做ChIP-qPCR， anti acetyl Histone H3 and H4, 将来也会考虑做anti
methylation histones，现在遇到的问题
是，找不到合适的control gene primers. Millipore 公司提供的chip kits里用的
GAPDH。 但是我们领域有几篇文章是用
的beta globin和beta tubulin。我的老板说用我们领域已发表的。然后我查了一下他
们用的primer sequences，有意思的
是他们用的是小鼠，但是primer sequences和大鼠的基因是完全匹配的，而和小鼠有1
－2个碱基不匹配。并且beta
globin的primer在大鼠基因中扩增的是hemoglobin epsilone2，而在小鼠中最可能扩增
的是hemoglobin y， beta－like
embryonic chain。 我的问题是，如果我选择beta globin做为我的control gene，我
是否应该重新设计primer，还是说
我可以直接用人家发表的primer sequence？但是他们用的是sybr |
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H*g
发帖数: 2333 | 37 How many times have you replicated this western? |
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N***P
发帖数: 153 | 38 从一个肌肉样本提的总蛋白，分装在-80度。western blot两次。加了抗体，不到1分钟，两条
带就显示出来了。
另外我也尝试了跑胶，不转膜，直接coomassie blue染色。Coomassie blue染色后，在
Tris-HCl胶上相对应的地方，也是两条清晰的带。 |
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s**e
发帖数: 1523 | 41 从来都只有一条带。。。你做个positive control看看抗体有没有问题？如果胶是自己
做的，那就换commercial的胶试试。如果抗体没问题，胶也没问题，那你换个loading
control的蛋白吧，actin 或者tubulin之类的。 |
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U********S
发帖数: 1896 | 43 不是。
你另外需要一个housekeeping基因比如GAPDH，actin, 18s等等，这样每个样本有两个Ct值，一个是测试基因比如A另一个是housekeeping基因B，delta ct是同个样本A和B基因之间差值。由多个样本的话需要计算delta ct的平均值作为这一组的结果，同样方法计算得到另外一组的delta ct。两组delta ct的差值叫delta delta ct，代表实验组和对照组之间的差异，用公式2^(-delta delta ct)可以得到差异的倍数。多个样本之间的delta ct误差计算以及如何传递两组的误差到最后的倍数误差请参考user bulletin#2。 |
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C****7
发帖数: 270 | 44 我想卖的物品:
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w******e
发帖数: 1187 | 45 想用random primer做tissue RNA的RT，然后用GAPDH specific primers做qPCR as QC；
同时用aptamer specific primers做RT和qPCR。可以在RT这一步把两种primer放在
一个reaction里做吗？有什么可能的问题？
非常感谢！ |
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c******r
发帖数: 3778 | 46 这个很简单，仔细想想就明白了。
当然不可以。random primer不能用来做qPCR。原因是这个是random的，所以对各个RNA
的RT efficiency是不一样的，所以以后的qPCR都没意义了。
如果要qPCR可以用polyA或者target specific primers。但是也不能混用。原因是
polyA会RT，而你的specific primers也可以RT，结果是你的target被polyA和specific
primers分别RT，而QC只被polyA RT。但是poly A和specific primer的RT efficiency
是不一样的，所以二者不再可比。
所以只能要么用poly A，要么target和control都用specific primers。
btw，gapdh的做RT是有kit的，买一个就可以了吧？
QC； |
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h*******o
发帖数: 4884 | 47 麻烦能不能再解释的清楚一点
我现在的case是就2个group, ctrl 和Treatment
用得actin+GAPDH做得internal control
所有其他的target 都normalize了
然后软件又给出了treatment group的fold change和P value
做cluster/heatmap的时候，有2个选择一个是Pearson Correlation一个是Euclidean
distance.
因为我就2个group，所以我想看看每个group的individual sample怎么cluster
发现不管用那个方法，图都还行，每组6个sample里面5个都cluster在一起，只有一个
会跳到另外一组的sample中间
但是pearson 和Euclidean的差别在于 不同的target gene被放在一起了
这个有区别吗？
谢谢 |
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Z******5
发帖数: 435 | 48 比如说我要检测没有处理的细胞Con和处理后的细胞Tre之间基因G表达的变化，那么就
是要分别定量Con和Tre cDNA中基因G和内参GAPDH的量。 要看基因G的变化，就是看它
在实验组和对照组中相对于内参的变化。 这个应该算是同一个模板里不同基因的相对
定量吧。 |
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Z******5
发帖数: 435 | 49 我也分特了，我的意思是比如定对照组中基因G和GAPDH的量时，应该先把模板，mix之
类的加到一起，最后分装之后再加引物。 |
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c******r
发帖数: 3778 | 50 同学，你这个连term都乱用啊
模板是说template，就是你的cDNA。
你的例子中必须按2做，1有systematic error，你看不出来？
你的目的是比较Con和Tre的中以GAPDH做reference时候G的区别。所以是比较模板的区
别。
因此你需要把没差别的东西都一同混合，减少因为这些东西差别引起的系统误差。这里
面包括：MasterMix，Dye，水，所有primers等等，就是除了你的cDNA之外的所有东西
。然后分装到PCR plate上。然后把cDNA直接加到你的plate上，这样你的每一个well直
接的差别就是你的cDNA的差别，不是primer的差别。
另外，其实，你可以做one-step RT-PCR，定量更准确。 |
|
