f*******d
发帖数: 92 | 1 小妹刚刚开始做NfkB pathway.
想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
labeled, 序列如下：AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响，所以就在细胞系里面建立了
luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候，用
TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候，我的treatment
确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样，是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb，大家用 EMSA
DNA 序列会跟这个reporter的DNA序列不一样呢？请牛人指导一下吧！ |
S*********s
发帖数: 304 | 2 我觉得你luciferase assay有问题。
一般TNF刺激, NF-KB luc reporter应该有100 fold左右的差别。
According to 某免疫大牛，<10 fold的他们认为太trivial
可以QPCR做几个下游的基因看看
另外如果真的觉得有变化，不妨做RNASeq or array.
biotin
treatment
EMSA
【在 f*******d 的大作中提到】
: 小妹刚刚开始做NfkB pathway.
: 想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
: 了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
: labeled, 序列如下：AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
: 然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响，所以就在细胞系里面建立了
: luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候，用
: TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候，我的treatment
: 确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
: DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样，是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
: GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb，大家用 EMSA
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f*******d
发帖数: 92 | 3 多谢！ 但是他的下游基因太多了，不知道从哪几个入手，有必要买一个qPCR array 吗？
【在 S*********s 的大作中提到】
: 我觉得你luciferase assay有问题。
: 一般TNF刺激, NF-KB luc reporter应该有100 fold左右的差别。
: According to 某免疫大牛，<10 fold的他们认为太trivial
: 可以QPCR做几个下游的基因看看
: 另外如果真的觉得有变化，不妨做RNASeq or array.
:
: biotin
: treatment
: EMSA
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S*********s
发帖数: 304 | 4 看看 David Baltimore的paper
biotin
treatment
EMSA
【在 f*******d 的大作中提到】
: 小妹刚刚开始做NfkB pathway.
: 想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
: 了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
: labeled, 序列如下：AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
: 然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响，所以就在细胞系里面建立了
: luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候，用
: TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候，我的treatment
: 确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
: DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样，是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
: GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb，大家用 EMSA
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c******a
发帖数: 267 | 5 是的，做过的估计都会觉得10倍的增加太少了，尤其是用tnf刺激的。当然我不知道你
处理多长时间以后测的luciferase activity.
qPCR随便做几个well-characterized 下游基因就好了，比如TNFa, IL6, IkBa, IL8之
类的
另外，IkBa Western 和EMSA的结果都要比luciferase assay更可靠吧。 |
f*******d
发帖数: 92 | 6 我做了几个时间点，2，4，8 小时的都是大概8－10倍的扩增，24小时之后降到了5倍。
主要是这个assay结果出不来，心里总觉得有什么不对。。。。。不过qPCR是个好主意
【在 c******a 的大作中提到】
: 是的，做过的估计都会觉得10倍的增加太少了，尤其是用tnf刺激的。当然我不知道你
: 处理多长时间以后测的luciferase activity.
: qPCR随便做几个well-characterized 下游基因就好了，比如TNFa, IL6, IkBa, IL8之
: 类的
: 另外，IkBa Western 和EMSA的结果都要比luciferase assay更可靠吧。
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c********b
发帖数: 363 | 7 http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=7EDAC33E-3981-4E58-8A
biotin
treatment
EMSA
【在 f*******d 的大作中提到】
: 小妹刚刚开始做NfkB pathway.
: 想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
: 了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
: labeled, 序列如下：AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
: 然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响，所以就在细胞系里面建立了
: luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候，用
: TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候，我的treatment
: 确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
: DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样，是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
: GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb，大家用 EMSA
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f*******d
发帖数: 92 | 8 我EMSA已经做了，就是用的这个kit。
【在 c********b 的大作中提到】
: http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=7EDAC33E-3981-4E58-8A
:
: biotin
: treatment
: EMSA
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f*******d
发帖数: 92 | 9 有人来帮我看看这个序列嘛？会不会是DNA序列不对呢？ |
t****t
发帖数: 86 | |
f*******d
发帖数: 92 | 11 多谢！那为啥做EMSA的序列和做luciferase reporter的序列不一样呢～
【在 t****t 的大作中提到】
: 序列看起来是经典NF-kB结合序列。
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t****t
发帖数: 86 | |
