e**e 发帖数: 166 | 1 我的蛋白是高尔基体上膜蛋白复合体。大概400-500Dka。
我用NP40 溶解后,用60%的(NH4)2SO4沉淀可以得到60%的活性。 现在
过分子筛柱。
我有个(LKB Triacryl GF200)的柱子 (1。6 x 60cm) (120,000-
15,000,000)。 我用Hepes buffer (1ml/min的流速。 我在用Blue
Dextran (MW 2,000,000)和BSA 的时候, 发现他们同时一起出来了。
这个柱子可以分离吗? 还有别的建议吗? |
e****s 发帖数: 1125 | 2 不是完全看懂了。
你应该是问分子筛能不能用来分离你这个大的Complex,是从cell lysate还是纯蛋白
reconstructed的complex?
如果是salt cut 后的样品直接上gel filtration, 应该是不行的。 分子筛通常也极少
用于第一步的初提。
如果是pure protein重构的复合物,那就看单体的大小了。明显BSA左右的蛋白 (~
60kd?)是分不开的,都在死体积里出来了。
【在 e**e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我的蛋白是高尔基体上膜蛋白复合体。大概400-500Dka。 : 我用NP40 溶解后,用60%的(NH4)2SO4沉淀可以得到60%的活性。 现在 : 过分子筛柱。 : 我有个(LKB Triacryl GF200)的柱子 (1。6 x 60cm) (120,000- : 15,000,000)。 我用Hepes buffer (1ml/min的流速。 我在用Blue : Dextran (MW 2,000,000)和BSA 的时候, 发现他们同时一起出来了。 : 这个柱子可以分离吗? 还有别的建议吗?
|
e**e 发帖数: 166 | 3 谢谢你的答复
我的蛋白复合体是植物组织中提取的天然蛋白。 我测到其中的一个糖基转移酶活性很
高,所以想纯化出来做proteomics. 我的设想是cell lysate 做盐析,然后过sec gel
filtration
最后做离子交换柱。 请问你有什么好的建议吗?
谢谢 |
e****s 发帖数: 1125 | 4 你的复合物是什么概念,会这么稳定?!
比如离子柱要用高盐洗脱,高盐会不会破坏你的复合物呢?
Anyway,如果是分子筛+离子的话,我会先试离子柱子,然后分子筛。
离子柱子有很好的浓缩作用,如果盐析没有对纯度有太大帮助的化,直接上离子柱子。
反过来,分子筛比较时候最后的精细纯化。你的样品体积不能太大,量不能太高。所以
,分子筛不适合当第一个柱子,样品太脏。
gel
【在 e**e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢你的答复 : 我的蛋白复合体是植物组织中提取的天然蛋白。 我测到其中的一个糖基转移酶活性很 : 高,所以想纯化出来做proteomics. 我的设想是cell lysate 做盐析,然后过sec gel : filtration : 最后做离子交换柱。 请问你有什么好的建议吗? : 谢谢
|
e**e 发帖数: 166 | 5 你的建议很好。 我的蛋白复合体应该是二硫键结合的。 我的蛋白盐析以后用PD10去
盐, 浓缩用Amicon。 活性保持的还可以。所以离子柱应该不会破坏蛋白。
请问离子柱和分子筛你有什么推荐的产品吗? |