v***a 发帖数: 1242 | 1 请见附图:
1-3为同一批次收的细胞,4-11为另一批次的。
考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间,故未用DNase I处理RNA。
做的是siRNA gene knockdown实验,其中1、4、11是Ctrl,其余为目标gene silencing.
S16扩增出来都还可以,同时扩增目标gene,结果就不行了。Ctrl(4、11)都很难辨认。
重新设计了primer也仍旧如此。
请高手赐教。。。 |
y******s 发帖数: 92 | 2 PCR效率问题。
1. 目标DNA GC rich的加DMSO试试。
2. 以PC样品11为模板,做个annealing的gradient,选个最合适的温度,可适当增加
cycle数。
3. 换一对primer,目的扩增片段稍短一些,避开难扩增区域。
4. PCR样品在4度assembly。
5. 换个针对性的polymerase。
这5个都试一下,试不出来才怪。
silencing.
认。
【在 v***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 请见附图: : 1-3为同一批次收的细胞,4-11为另一批次的。 : 考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间,故未用DNase I处理RNA。 : 做的是siRNA gene knockdown实验,其中1、4、11是Ctrl,其余为目标gene silencing. : S16扩增出来都还可以,同时扩增目标gene,结果就不行了。Ctrl(4、11)都很难辨认。 : 重新设计了primer也仍旧如此。 : 请高手赐教。。。
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v***a 发帖数: 1242 | 3 谢谢。1、5没试过。
问题是我的这些sample基本都是duplicate dish,细胞情况类似,为什么有的target
gene可以扩增到,而有的完全不可以呢?
包子已发。
【在 y******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : PCR效率问题。 : 1. 目标DNA GC rich的加DMSO试试。 : 2. 以PC样品11为模板,做个annealing的gradient,选个最合适的温度,可适当增加 : cycle数。 : 3. 换一对primer,目的扩增片段稍短一些,避开难扩增区域。 : 4. PCR样品在4度assembly。 : 5. 换个针对性的polymerase。 : 这5个都试一下,试不出来才怪。 : : silencing.
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y******s 发帖数: 92 | 4 如果GC Rich (>60%)的话试1应该就可以了 (try gradient or 3% DMSO)。
样品制备不均一等原因,总会有系统误差。
另外奇怪的是,如果检测RNAi的效率,用Q-PCR啊,半定量太落伍了,你的control如果
是饱和了,根本反映不了你上样量的差别。
【在 v***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢。1、5没试过。 : 问题是我的这些sample基本都是duplicate dish,细胞情况类似,为什么有的target : gene可以扩增到,而有的完全不可以呢? : 包子已发。
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v***a 发帖数: 1242 | 5 谢谢你,回头试试1. 打算这个做出来了就上qPCR……现在只求确实有KD就行。
【在 y******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果GC Rich (>60%)的话试1应该就可以了 (try gradient or 3% DMSO)。 : 样品制备不均一等原因,总会有系统误差。 : 另外奇怪的是,如果检测RNAi的效率,用Q-PCR啊,半定量太落伍了,你的control如果 : 是饱和了,根本反映不了你上样量的差别。
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l***y 发帖数: 638 | 6 直接western吧,反正KD光测个RNA也没啥意义
【在 v***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢你,回头试试1. 打算这个做出来了就上qPCR……现在只求确实有KD就行。
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C**S 发帖数: 522 | 7 "设计的引物跨越了好几个intron和extron区间"
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设计的PCR产物估计太长了,扩增效率很低的。 |
v***a 发帖数: 1242 | 8 找不到好的特异性高的抗体,WB出来都没有变化。所以用RNA看。痛苦。
【在 l***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 直接western吧,反正KD光测个RNA也没啥意义
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v***a 发帖数: 1242 | 9 现在这个产物是300多bp的,应该还好?
【在 C**S 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : "设计的引物跨越了好几个intron和extron区间" : ----------------------- : 设计的PCR产物估计太长了,扩增效率很低的。
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b****r 发帖数: 17995 | 10 也许引物问题,根本不是扩的你想要的东西。测序证实一下先再往下做吧 |
d****i 发帖数: 2346 | 11
能不能再短点看看。300对我来说心里不塌实的。。
【在 v***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 现在这个产物是300多bp的,应该还好?
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m***o 发帖数: 272 | 12 大家都不用DNAse处理吗?有DNA也会影响你的PCR 效率.而且不要相信什么跨几个intron
,统统处理一下,没坏处. |
g*********9 发帖数: 3528 | 13 有些RNA的确copy很低的,虽然蛋白看着还成。
silencing.
认。
【在 v***a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 请见附图: : 1-3为同一批次收的细胞,4-11为另一批次的。 : 考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间,故未用DNase I处理RNA。 : 做的是siRNA gene knockdown实验,其中1、4、11是Ctrl,其余为目标gene silencing. : S16扩增出来都还可以,同时扩增目标gene,结果就不行了。Ctrl(4、11)都很难辨认。 : 重新设计了primer也仍旧如此。 : 请高手赐教。。。
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v***a 发帖数: 1242 | 14 多谢。打算以后都要用Dnase处理。
intron
【在 m***o 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 大家都不用DNAse处理吗?有DNA也会影响你的PCR 效率.而且不要相信什么跨几个intron : ,统统处理一下,没坏处.
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