c*****8
发帖数: 49 | 1 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
，都不成功。
都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
，但酶切鉴定也不对。
现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。 |
M******g
发帖数: 152 | 2 Try Gibson Assembly plus NEB 10 beta competent cells from NEB. I now use
Gibson Assembly to do all of my cloning work. Very easy, and none of them
failed.
Good luck. |
p*****e
发帖数: 93 | 3 再找一个酶切位点，分步克隆上去。载体和基因大小太接近。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
|
n****3
发帖数: 543 | 4 你要对载体去磷酸化，我克隆了3kb到27kb的载体内通过notI, 挑了5个有3个是， 测
序鉴定没有问题 |
s*****i
发帖数: 315 | 5 你的载体片段多大？如果载体片段5～7k，几乎不可能得到养性克隆，最好载体和
insert的大小差距比较大，这样容易连接成功。
如果出现载体跟insert差不多大小的情况，最好分段克隆上去，或是用Gibson
Assembly
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
|
k*****n
发帖数: 323 | 6 我不是高手，但是这方法简单靠谱
【在 n****3 的大作中提到】
: 你要对载体去磷酸化，我克隆了3kb到27kb的载体内通过notI, 挑了5个有3个是， 测
: 序鉴定没有问题
|
d****i
发帖数: 2346 | 7 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
。 |
a*****1
发帖数: 3134 | 8 这招太损了。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
|
x**2
发帖数: 255 | 9 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
不是想要的。
请问有什么诀窍么？
谢谢！
我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
|
b******n
发帖数: 4225 | 10 什么学校还有自产的DH5alpha competant cell啊？
【在 x**2 的大作中提到】
: 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
: 3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
: 我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
: 切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
: 接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
: 不是想要的。
: 请问有什么诀窍么？
: 谢谢！
: 我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
:
|
|
|
y******s
发帖数: 92 | 11 太扯了
triple-ligation的难度提高10倍吧
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
|
y******s
发帖数: 92 | 12 这个就是片段太大转化效率低的问题
去买个10^9的超级感受态细胞，你的问题立马解决
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
|
H*******i
发帖数: 196 | 13 和酶有关，常用酶（可以片段自连），差不多是这样
如果末端是4个碱基且非反向互补，三片段效率还是很高的。
【在 y******s 的大作中提到】
: 太扯了
: triple-ligation的难度提高10倍吧
:
: ligation
|
y******s
发帖数: 92 | 14 原帖的意思是，把一个完整的片段中间切一刀，再用酶把它连成完整片段做克隆，因此
可以提高成功率
我感觉要么就是开玩笑（unlikely），要么就是完全不知道克隆的原理
【在 H*******i 的大作中提到】
: 和酶有关，常用酶（可以片段自连），差不多是这样
: 如果末端是4个碱基且非反向互补，三片段效率还是很高的。
|
y*****5
发帖数: 567 | 15 你自己的载体上这两个酶切位点挨得近不近？如果是相邻的两个，那么有一个酶没有切
开。要换酶。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
|
y*****5
发帖数: 567 | 16 哦，楼上有人说的对10K以上的话，要用电转化法，或买高效的转化态细胞。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
|
l******a
发帖数: 3339 | 17 顶礼膜拜一下，幸好你不是我师兄，不然得走多少弯路。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
|
d****i
发帖数: 2346 | 18 既然这么多人抨击我说的triple ligation，有说我损的，有说我不懂克隆的，那我就
收回我说的吧。对不起大家了。
我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
再次对大家表示对不起！ |
m*****z
发帖数: 1451 | 19 信息量太少了。载体CIP了吗？什么酶切位点？什么载体？酶切鉴定怎么不对？可能性
太多啦。
我做过9kb+9kb的平末端连接，PUC vector和lentiviral vector都做过，转的是自己做
的感受态，都没有问题。载体要CIP干净，连接要过夜，比例1:1左右。其他没有了。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
|
m*****z
发帖数: 1451 | 20 又是一个。。。克隆不是自己想要的，到底怎么不是？即使是失败的实验也可以告诉你
很多东西的。
【在 x**2 的大作中提到】
: 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
: 3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
: 我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
: 切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
: 接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
: 不是想要的。
: 请问有什么诀窍么？
: 谢谢！
: 我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
:
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z**********1
发帖数: 3 | 21 问题解决了么？
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
|
s*****i
发帖数: 315 | 22 我挺你，我经常做三段连，成功率非常高；有两次做过四段连，虽然得到我想要的，但
是效率低，就放弃了。楼主做不出来的根本原因是载体和插入片段大小一样，你是明眼
人，看出问题所在了。不要理会别人的议论。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
【在 d****i 的大作中提到】
: 既然这么多人抨击我说的triple ligation，有说我损的，有说我不懂克隆的，那我就
: 收回我说的吧。对不起大家了。
: 我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
: 同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
: 再次对大家表示对不起！
|
s*****i
发帖数: 315 | 23 为什么说做三段连就不懂分子克隆原理？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
【在 y******s 的大作中提到】
: 原帖的意思是，把一个完整的片段中间切一刀，再用酶把它连成完整片段做克隆，因此
: 可以提高成功率
: 我感觉要么就是开玩笑（unlikely），要么就是完全不知道克隆的原理
|
b***2
发帖数: 348 | 24 做过一次5k+4.3k的，做了很长时间都没有做出来，不过最后还是做出来了。
当时的做法是1.增加inert的量，比例做到9:1。
2.16度过夜连接
3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺 |
c*****8
发帖数: 49 | 25 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
，都不成功。
都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
，但酶切鉴定也不对。
现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。 |
M******g
发帖数: 152 | 26 Try Gibson Assembly plus NEB 10 beta competent cells from NEB. I now use
Gibson Assembly to do all of my cloning work. Very easy, and none of them
failed.
Good luck. |
p*****e
发帖数: 93 | 27 再找一个酶切位点，分步克隆上去。载体和基因大小太接近。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
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n****3
发帖数: 543 | 28 你要对载体去磷酸化，我克隆了3kb到27kb的载体内通过notI, 挑了5个有3个是， 测
序鉴定没有问题 |
s*****i
发帖数: 315 | 29 你的载体片段多大？如果载体片段5～7k，几乎不可能得到养性克隆，最好载体和
insert的大小差距比较大，这样容易连接成功。
如果出现载体跟insert差不多大小的情况，最好分段克隆上去，或是用Gibson
Assembly
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
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k*****n
发帖数: 323 | 30 我不是高手，但是这方法简单靠谱
【在 n****3 的大作中提到】
: 你要对载体去磷酸化，我克隆了3kb到27kb的载体内通过notI, 挑了5个有3个是， 测
: 序鉴定没有问题
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d****i
发帖数: 2346 | 31 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
。 |
a*****1
发帖数: 3134 | 32 这招太损了。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
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x**2
发帖数: 255 | 33 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
不是想要的。
请问有什么诀窍么？
谢谢！
我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
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b******n
发帖数: 4225 | 34 什么学校还有自产的DH5alpha competant cell啊？
【在 x**2 的大作中提到】
: 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
: 3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
: 我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
: 切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
: 接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
: 不是想要的。
: 请问有什么诀窍么？
: 谢谢！
: 我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
:
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y******s
发帖数: 92 | 35 太扯了
triple-ligation的难度提高10倍吧
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
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y******s
发帖数: 92 | 36 这个就是片段太大转化效率低的问题
去买个10^9的超级感受态细胞，你的问题立马解决
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
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H*******i
发帖数: 196 | 37 和酶有关，常用酶（可以片段自连），差不多是这样
如果末端是4个碱基且非反向互补，三片段效率还是很高的。
【在 y******s 的大作中提到】
: 太扯了
: triple-ligation的难度提高10倍吧
:
: ligation
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y******s
发帖数: 92 | 38 原帖的意思是，把一个完整的片段中间切一刀，再用酶把它连成完整片段做克隆，因此
可以提高成功率
我感觉要么就是开玩笑（unlikely），要么就是完全不知道克隆的原理
【在 H*******i 的大作中提到】
: 和酶有关，常用酶（可以片段自连），差不多是这样
: 如果末端是4个碱基且非反向互补，三片段效率还是很高的。
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y*****5
发帖数: 567 | 39 你自己的载体上这两个酶切位点挨得近不近？如果是相邻的两个，那么有一个酶没有切
开。要换酶。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
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y*****5
发帖数: 567 | 40 哦，楼上有人说的对10K以上的话，要用电转化法，或买高效的转化态细胞。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
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l******a
发帖数: 3339 | 41 顶礼膜拜一下，幸好你不是我师兄，不然得走多少弯路。
ligation
【在 d****i 的大作中提到】
: 在你的insert中间切一刀，变成两个小段，然后和6k的vector连接，triple-ligation
: 。
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d****i
发帖数: 2346 | 42 既然这么多人抨击我说的triple ligation，有说我损的，有说我不懂克隆的，那我就
收回我说的吧。对不起大家了。
我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
再次对大家表示对不起！ |
m*****z
发帖数: 1451 | 43 信息量太少了。载体CIP了吗？什么酶切位点？什么载体？酶切鉴定怎么不对？可能性
太多啦。
我做过9kb+9kb的平末端连接，PUC vector和lentiviral vector都做过，转的是自己做
的感受态，都没有问题。载体要CIP干净，连接要过夜，比例1:1左右。其他没有了。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
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m*****z
发帖数: 1451 | 44 又是一个。。。克隆不是自己想要的，到底怎么不是？即使是失败的实验也可以告诉你
很多东西的。
【在 x**2 的大作中提到】
: 我最近在做triple ligation，试过不同的insert1:insert2:vector ratio（1：1：1，
: 3：3：1和6：6：1）但是都不成功。请问有什么诀窍么？
: 我的insert已经克隆到其他vector了，所以我知道双酶切没有问题。同样我也知道双酶
: 切的vector没有问题。在连接体系中我的dna浓度是150ng/20ul，之后16度用NEB的T4连
: 接酶过夜后转化到学校自己生产的DH5alpha competant cell中，有过几个菌落，但都
: 不是想要的。
: 请问有什么诀窍么？
: 谢谢！
: 我现在只好先连接上一个片段，再连另一个了。
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z**********1
发帖数: 3 | 45 问题解决了么？
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
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s*****i
发帖数: 315 | 46 我挺你，我经常做三段连，成功率非常高；有两次做过四段连，虽然得到我想要的，但
是效率低，就放弃了。楼主做不出来的根本原因是载体和插入片段大小一样，你是明眼
人，看出问题所在了。不要理会别人的议论。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
【在 d****i 的大作中提到】
: 既然这么多人抨击我说的triple ligation，有说我损的，有说我不懂克隆的，那我就
: 收回我说的吧。对不起大家了。
: 我之所以这么说，是因为我以前也碰到过类似的问题就是这样解决的。
: 同样大小两个片段连接肯定能连上，但是好不好做成功率多少至少在我手里不好。
: 再次对大家表示对不起！
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s*****i
发帖数: 315 | 47 为什么说做三段连就不懂分子克隆原理？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
【在 y******s 的大作中提到】
: 原帖的意思是，把一个完整的片段中间切一刀，再用酶把它连成完整片段做克隆，因此
: 可以提高成功率
: 我感觉要么就是开玩笑（unlikely），要么就是完全不知道克隆的原理
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b***2
发帖数: 348 | 48 做过一次5k+4.3k的，做了很长时间都没有做出来，不过最后还是做出来了。
当时的做法是1.增加inert的量，比例做到9:1。
2.16度过夜连接
3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺 |
s********s
发帖数: 67 | |
l**********1
发帖数: 5204 | 50 Mark.
【在 b***2 的大作中提到】
: 做过一次5k+4.3k的，做了很长时间都没有做出来，不过最后还是做出来了。
: 当时的做法是1.增加inert的量，比例做到9:1。
: 2.16度过夜连接
: 3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺
|
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i***l
发帖数: 1656 | 51 i agree these, am using these tricks myself and efficiency is higher.
1.增加inert的量，比例做到9:1。
2.16度过夜连接(16c >=4hr , at least)
3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺 (i usually recover for 2hr)
【在 b***2 的大作中提到】
: 做过一次5k+4.3k的，做了很长时间都没有做出来，不过最后还是做出来了。
: 当时的做法是1.增加inert的量，比例做到9:1。
: 2.16度过夜连接
: 3.transformation结束后，加lb摇3个小时再铺
|
g*********3
发帖数: 177 | 52 如果insert和backbone大小一样，我试过1：1的ratio，成功率比较高。。。。 |
C****n
发帖数: 79 | 53 不知道你解决了没有。
昨天做了一个类似的，只不过我是5k + 5k
I assume 你gel extraction是干净彻底的
我用的molar ratio 是1:1，我不知道你为什么要用3:1或者其他的。为什么一定要认定
一个是insert，而另一个是plasmid呢，为什么不能换一下？
我用的是NEB的普通T4 DNA ligase， 连接1小时（普通的我一般是连接20min，也值按
照Protocol上说的），因为片段比较大。
I assume 你的感受态是没有问题的。
最后我提醒一下你，有时候酶切验证会失败，原因是不你克隆失败，而是其他原因，比
如甲基化。
Touble-shooting一下，不要漫天考虑太多的因素。
Hope it helps.
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
|
m*********r
发帖数: 49 | |
H*********a
发帖数: 133 | 55 我也常用三片段链接，效果都不错。
【在 s*****i 的大作中提到】
: 我挺你，我经常做三段连，成功率非常高；有两次做过四段连，虽然得到我想要的，但
: 是效率低，就放弃了。楼主做不出来的根本原因是载体和插入片段大小一样，你是明眼
: 人，看出问题所在了。不要理会别人的议论。
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
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m*******t
发帖数: 482 | 56 克隆做出来了吗？如果还没有，查查是什么载体，如果是ＲＥＴＲＯＶＩＲＵＳ ＶＥ
ＣＴＯＲ就比较讨厌。谁有什么好办法，给俺也说说。俺想插一段四ＫＢ的片段进ＰＭ
ＸＳ－ＧＦＰ载体，后来没做成就算了。 |
a*******a
发帖数: 4233 | 57 我这么做出来过…
【在 y******s 的大作中提到】
: 太扯了
: triple-ligation的难度提高10倍吧
:
: ligation
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n****k
发帖数: 516 | 58 最近经常做差不多大小的片段连接，可以参考下我的条件
1.载体去磷酸化
2.高效率感受态细胞
3.insert:vector大概6:1-9:1
4.足够的DNA，我10ul体系里面大概加100ng
5.我用NEB的连接酶，一般连接RT放一个小时
6.酶切时间不要太长，1-3小时+0.5-1小时载体去磷酸化
7.不要太相信酶切鉴定，我有一个载体，重做了2次，每次酶切位点都突变，可以连进
去，但是切不出来了，建议lz做PCR鉴定之后送测序。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
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f**u
发帖数: 346 | 59 不明白为什么好几个人都说vector和insert大小差不多就不好连，这个有什么讲究吗？
我好像从没注意到有什么区别 |
x*****e
发帖数: 309 | 60 看来做cloning 的人还真不少，其实我建议不要纠结于连接了。设计PCR得到5+5=10kb
的片段，注意设计引物的时候5端磷酸化修饰，然后直接T4 ligase连接 10 kb的片段，
相当于自连，容易很多，PCR酶可以用NEB的fusion，说明书上说可以扩增22kb的片段。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
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C**S
发帖数: 522 | 61 刚做了一个retroviral plasmid，5k的载体，6k的基因，大概1：1比例，室温连接6个
小时，转化top10，筛了几个克隆，全都对。不知道你的问题出在哪里。
【在 c*****8 的大作中提到】
: 正在做一个克隆，从别人的载体上切下了一个6k的基因，用同样的两个酶切了自己的载
: 体，酶切后的载体也是6k，现在想把这6k的片段克隆到6k的载体里。可是尝试了好多次
: ，都不成功。
: 都是转的top10，比例从3：1，到6：1都试过了，要不就是没有克隆，有时有几个克隆
: ，但酶切鉴定也不对。
: 现在急死了，高手们给点建议啊，感激不尽。
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