l******3
发帖数: 25 | 1 最近想建一个某基因高表达的细胞系，然后做microarray找一些该基因的关联基因，先
不谈这样找到的基因是否准确，单说建这个高表达的细胞系。
我能不能直接用慢病毒感染，然后做facs sorting？但是我想这样得到的population都
不是从一个单克隆来的，microarray的结果肯定相差很大。
我试着用pcDNA3.1做载体转细胞，然后用G418筛，但是转染效率不高（基因比较大，将
近7k），所以导致筛到后面克隆很少，因为用的细胞本身就长得很慢，所以仅有的几个
单克隆长了很久也没有长起来。
大家有没有什么好的建议呢？谢谢！ |
s******s
发帖数: 13035 | 2
你筛个单克隆出来不就行了，还是因为长的慢？不是单克隆也没啥问题啊，
平均减小误差嘛。
G418是一个烂药，除非不得已，否则应该上puro
【在 l******3 的大作中提到】
: 最近想建一个某基因高表达的细胞系，然后做microarray找一些该基因的关联基因，先
: 不谈这样找到的基因是否准确，单说建这个高表达的细胞系。
: 我能不能直接用慢病毒感染，然后做facs sorting？但是我想这样得到的population都
: 不是从一个单克隆来的，microarray的结果肯定相差很大。
: 我试着用pcDNA3.1做载体转细胞，然后用G418筛，但是转染效率不高（基因比较大，将
: 近7k），所以导致筛到后面克隆很少，因为用的细胞本身就长得很慢，所以仅有的几个
: 单克隆长了很久也没有长起来。
: 大家有没有什么好的建议呢？谢谢！
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a*******a
发帖数: 4233 | 3 用lenti会比较好，因为lenti不是从单细胞来的，所以能排除单克隆基因型不稳定及目
的片段特异插入带来的问题。
基因比较大还是载体比较大？pc3.1大概5k,也就是说你的目的基因3k大，lenti还是放
得下的。如果是你的目的基因就7k，那就麻烦了
搞不好瞬转表达也有问题。
【在 l******3 的大作中提到】
: 最近想建一个某基因高表达的细胞系，然后做microarray找一些该基因的关联基因，先
: 不谈这样找到的基因是否准确，单说建这个高表达的细胞系。
: 我能不能直接用慢病毒感染，然后做facs sorting？但是我想这样得到的population都
: 不是从一个单克隆来的，microarray的结果肯定相差很大。
: 我试着用pcDNA3.1做载体转细胞，然后用G418筛，但是转染效率不高（基因比较大，将
: 近7k），所以导致筛到后面克隆很少，因为用的细胞本身就长得很慢，所以仅有的几个
: 单克隆长了很久也没有长起来。
: 大家有没有什么好的建议呢？谢谢！
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l******3
发帖数: 25 | 4 是目的基因就有6k多，克隆到lentivirus载体里，在做流式sorting，可行吗？ |
a*******a
发帖数: 4233 | 5 你的目的基因6k，再加上efgp marker就要奔7k去了。
首先很难表达（也许可以表达）其次很难包装。
如果过表达以后对细胞生长有不利影响则很难拿到纯population。
我做过3.xk的基因+ires gfp感染mES细胞，阳性率只有2%。
facs能得到50%阳性细胞，养几代后二次facs时发现阳性率又掉到10%
折腾了几个月最后放弃了。
也许你可以考虑用bac的方法做过表达稳定株
你去看一下Kristian Helin的tet1文章。记得他稳转了全长6k多的TET1，
TET1很长，我们尝试了很久始终不能有效表达。
当时他来我们实验室转的时候问过他这个问题，好像他是用bac解决的，记不清了。
【在 l******3 的大作中提到】
: 是目的基因就有6k多，克隆到lentivirus载体里，在做流式sorting，可行吗？
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C**S
发帖数: 522 | 6 我最近也在装一个载体，把一个5k的基因装到pEGFP－C1载体再把GFP fusion蛋白装到
pBabe retroviral里。酶切测序都对，就是转到293T细胞里只能看到极少数细胞GFP阳
性。真的是因为基因太大了？谢谢。
【在 a*******a 的大作中提到】
: 你的目的基因6k，再加上efgp marker就要奔7k去了。
: 首先很难表达（也许可以表达）其次很难包装。
: 如果过表达以后对细胞生长有不利影响则很难拿到纯population。
: 我做过3.xk的基因+ires gfp感染mES细胞，阳性率只有2%。
: facs能得到50%阳性细胞，养几代后二次facs时发现阳性率又掉到10%
: 折腾了几个月最后放弃了。
: 也许你可以考虑用bac的方法做过表达稳定株
: 你去看一下Kristian Helin的tet1文章。记得他稳转了全长6k多的TET1，
: TET1很长，我们尝试了很久始终不能有效表达。
: 当时他来我们实验室转的时候问过他这个问题，好像他是用bac解决的，记不清了。
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a*******a
发帖数: 4233 | 7 我不确定，不排除这个可能
我用pcdna3.1接6k多带n端和c端tag的tet1
转染後用if检测，只有不超过2%的细胞是阳性，换过ubc ef1a启动子都没什么改善。还
做过几个类似大小的蛋白都是类似现象。
但是转9k的lv载体加3k的蛋白再加1.5k的ires gfp，蛋白表达的就很好。排除质粒太大
转染效率不高的可能。
后来我的解决办法是不做这么大的基因了。
【在 C**S 的大作中提到】
: 我最近也在装一个载体，把一个5k的基因装到pEGFP－C1载体再把GFP fusion蛋白装到
: pBabe retroviral里。酶切测序都对，就是转到293T细胞里只能看到极少数细胞GFP阳
: 性。真的是因为基因太大了？谢谢。
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