c***d
发帖数: 142 | 1 设计了一对用于long PCR的引物
F引物:
5'- CTC GGC AAA CAY AAA CTC CGC CTG TTT ACC AAA AAC -3'
GC content (%): 44.44 to 47.22; Tm (degrees C): 73.39 to 74.96
R引物:
5'- C AAC GAT AGT TTT TCA AGT TRT TRG TCT TGG -3'
GC content (%): 31.25 to 37.50; Tm (degrees C): 65.40 to 69.16
两个引物的GC含量相差太大，Tm值也差一些。看网上说GC含量相差太大的话，扩增不容
易启动。F引物已和别的试过，很好。R引物前后几个碱基都不适合加进去来改进引物，
别的位置也没法设计引物。所以我在5'端随机加了几个G和C以提高GC含量和Tm温度，如
下：
R引物（前面加了几个G和C，不和模版match）:
5'- gcg gcC AAC GAT AGT TTT TCA AGT TRT TRG TCT TGG -3'
GC content (%): 41.67 to 47.22; Tm (degrees C): 71.47 to 74.72
这样可行吗？ |
s******a
发帖数: 472 | 2 我觉得Tm没有什么问题
你的F和R直接应该有dimerization的可能
AAAAA TTTTT
不知道能影响多少
【在 c***d 的大作中提到】
: 设计了一对用于long PCR的引物
: F引物:
: 5'- CTC GGC AAA CAY AAA CTC CGC CTG TTT ACC AAA AAC -3'
: GC content (%): 44.44 to 47.22; Tm (degrees C): 73.39 to 74.96
: R引物:
: 5'- C AAC GAT AGT TTT TCA AGT TRT TRG TCT TGG -3'
: GC content (%): 31.25 to 37.50; Tm (degrees C): 65.40 to 69.16
: 两个引物的GC含量相差太大，Tm值也差一些。看网上说GC含量相差太大的话，扩增不容
: 易启动。F引物已和别的试过，很好。R引物前后几个碱基都不适合加进去来改进引物，
: 别的位置也没法设计引物。所以我在5'端随机加了几个G和C以提高GC含量和Tm温度，如
|
c***d
发帖数: 142 | 3 你觉得5'端随机加了几个G和C没有问题？
【在 s******a 的大作中提到】
: 我觉得Tm没有什么问题
: 你的F和R直接应该有dimerization的可能
: AAAAA TTTTT
: 不知道能影响多少
|
x********e
发帖数: 35261 | 4 引物温度只看会match的碱基,大概是(A+T)*2+(G+C)*4
克隆引物后面加酶切位点也不影响温度,一个道理
【在 c***d 的大作中提到】
: 设计了一对用于long PCR的引物
: F引物:
: 5'- CTC GGC AAA CAY AAA CTC CGC CTG TTT ACC AAA AAC -3'
: GC content (%): 44.44 to 47.22; Tm (degrees C): 73.39 to 74.96
: R引物:
: 5'- C AAC GAT AGT TTT TCA AGT TRT TRG TCT TGG -3'
: GC content (%): 31.25 to 37.50; Tm (degrees C): 65.40 to 69.16
: 两个引物的GC含量相差太大，Tm值也差一些。看网上说GC含量相差太大的话，扩增不容
: 易启动。F引物已和别的试过，很好。R引物前后几个碱基都不适合加进去来改进引物，
: 别的位置也没法设计引物。所以我在5'端随机加了几个G和C以提高GC含量和Tm温度，如
|
c***d
发帖数: 142 | 5 5'端加几个G (to form wobble base pairs) 会不会好点？
【在 x********e 的大作中提到】
: 引物温度只看会match的碱基,大概是(A+T)*2+(G+C)*4
: 克隆引物后面加酶切位点也不影响温度,一个道理
|
s******a
发帖数: 472 | 6 没有问题。如上，也不会影响退火温度。
【在 c***d 的大作中提到】
: 你觉得5'端随机加了几个G和C没有问题？
|
c***d
发帖数: 142 | 7 谢谢
我的理解是，第一轮循环以后, 所加的随机序列将成为从50%到越来越多的template的
一部分，那个时候的退火温度(和GC含量)就是加了它们以后的了 也就是说只有和原
始基因组模版结合时才是原来的退火温度(和GC含量)
【在 s******a 的大作中提到】
: 没有问题。如上，也不会影响退火温度。
|
