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Biology版 - 做realtime PCR前,RNA要测浓度调正浓度吗?
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请教realtime的问题PCR std dev 总是太高。。。
有关qRT-PCR一问,请大家帮忙qPCR primer efficiency 问题
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相关话题的讨论汇总
话题: rna话题: 浓度话题: pcr话题: realtime话题: rt
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1 (共1页)
S**********g
发帖数: 109
1
提RNA--反转录PCR--realtime PCR,在这其中,提完RNA之后,要不要测RNA浓度吗?在
做反转录PCR之前,要把所有RNA样品调正为同一浓度吗?
有人认为不用,因为在做realtime PCR的时候,有内参作对比,所以不用,但有的人还
是说要调正浓度,到底应不应该调正呐?
谢谢
s******r
发帖数: 2876
2
你反转录的时候,难道不需要知道加了多少RNA吗?
太多的话,转录反应效率会不会受影响。

【在 S**********g 的大作中提到】
: 提RNA--反转录PCR--realtime PCR,在这其中,提完RNA之后,要不要测RNA浓度吗?在
: 做反转录PCR之前,要把所有RNA样品调正为同一浓度吗?
: 有人认为不用,因为在做realtime PCR的时候,有内参作对比,所以不用,但有的人还
: 是说要调正浓度,到底应不应该调正呐?
: 谢谢

S**********g
发帖数: 109
3
我对这个不是很懂所以才问,怎么样算是太多?会怎么样影响反转录效率,我一个师姐
告诉我的,提了RNA之后什么也别干快去反转录,不用测浓度因为realtime pcr时有内能

【在 s******r 的大作中提到】
: 你反转录的时候,难道不需要知道加了多少RNA吗?
: 太多的话,转录反应效率会不会受影响。

j******n
发帖数: 941
4

内能
在一定范围内你师姐说的是对的 尤其是每次提的细胞都差不多的时候 基本可以不测
按照之前的protocol加就行了 你师姐肯定是常做这种scale 心里有数
换一种情况 如果两个样品 一个RNA极端少 一个极端多 在同一个scale的反转中 那个
极端多的样品很可能反转不完全 导致最后结果与实际量比偏少 量太少也可能会导致后
面的PCR反应被背景信号干扰 导致假阳性 结果比实际量偏多 那肯定有就误差了呗

【在 S**********g 的大作中提到】
: 我对这个不是很懂所以才问,怎么样算是太多?会怎么样影响反转录效率,我一个师姐
: 告诉我的,提了RNA之后什么也别干快去反转录,不用测浓度因为realtime pcr时有内能

a*******a
发帖数: 4233
5
做个realtime那么急急吼吼的干啥
抽完赶紧去反转的目的是保证rna的完整性,主要是保证模板里面大片段不被破坏,以
后拉长基因,做文库好用
你一个realtime检测的是100多bp的东西,怕啥啦
师姐胸大不,不大就按我说的做去测浓度。
万一你没测浓度加了一样的体积去反转录,结果不幸有几个浓度太低反转效率不好,岂
不是要重新收集样品?

内能

【在 S**********g 的大作中提到】
: 我对这个不是很懂所以才问,怎么样算是太多?会怎么样影响反转录效率,我一个师姐
: 告诉我的,提了RNA之后什么也别干快去反转录,不用测浓度因为realtime pcr时有内能

w***a
发帖数: 4361
6
那要是师姐胸大呢?是不是就可以干脆不测了。。。

【在 a*******a 的大作中提到】
: 做个realtime那么急急吼吼的干啥
: 抽完赶紧去反转的目的是保证rna的完整性,主要是保证模板里面大片段不被破坏,以
: 后拉长基因,做文库好用
: 你一个realtime检测的是100多bp的东西,怕啥啦
: 师姐胸大不,不大就按我说的做去测浓度。
: 万一你没测浓度加了一样的体积去反转录,结果不幸有几个浓度太低反转效率不好,岂
: 不是要重新收集样品?
:
: 内能

n********e
发帖数: 1630
7
这个问题我遇到过。RNA 到cDNA, 不同的RNA 的浓度影响RT的效率,你可以做个
standard curve, 用一系列浓度,包括你估计的RNA 药品的浓度(通过preliminary的
RT pcr测) 如果你的样品差别不大,就没问题,如果你的样品浓度差别很大。有可能
浓度很低的样品,RT 效率也低。我遇到过。我的经验是 10^9 以上的copy number,
基本可以达到1 RNA 得到 1 cDNA, 但是这个浓度做qPCR 太高。如果是 10^2 - 10^7
copy RNA 做RT,效率会很低,我最好的结果是10%。这个10%是在这个范围内一致的。
所以也没问题。你用的是什么RTase, Superscript III 好一点,另外加点RNAase
inhibitor.
我曾经为这个RT step折腾了很久。。。后来知道,很多人都不这么做,直接拿内参。
。但是确实RT effeiciency在不同浓度是不一样的

【在 S**********g 的大作中提到】
: 提RNA--反转录PCR--realtime PCR,在这其中,提完RNA之后,要不要测RNA浓度吗?在
: 做反转录PCR之前,要把所有RNA样品调正为同一浓度吗?
: 有人认为不用,因为在做realtime PCR的时候,有内参作对比,所以不用,但有的人还
: 是说要调正浓度,到底应不应该调正呐?
: 谢谢

a******7
发帖数: 7936
8
我做的是测浓度,
按浓度加RNA到反转cDNA的体系里这样出来的cDNA浓度大约就是统一的
一般用Biorad的kit反转出来到1000ng/ul,我在N年前刚做PhD的时候还测过反转出的
cDNA浓度,比较一致的在1000~1100ng/ul之间,此后的N年里再也不测了,cDNA1:10稀
释后做PCR

【在 S**********g 的大作中提到】
: 提RNA--反转录PCR--realtime PCR,在这其中,提完RNA之后,要不要测RNA浓度吗?在
: 做反转录PCR之前,要把所有RNA样品调正为同一浓度吗?
: 有人认为不用,因为在做realtime PCR的时候,有内参作对比,所以不用,但有的人还
: 是说要调正浓度,到底应不应该调正呐?
: 谢谢

d****i
发帖数: 2346
9
强烈建议你测一下RNA浓度。。。当年做一个实验老是做不出差异来,很郁闷,后来自
己一个人在那里琢磨,去测了一下浓度,然后调整成同一个浓度,重复了一下realtime
,做出了显著差异。被老板狠狠鄙视了一下,至今还不能忘记那时候老板的眼神。。。
。。。。
l******a
发帖数: 3339
10
现在都是粗放流?

【在 S**********g 的大作中提到】
: 提RNA--反转录PCR--realtime PCR,在这其中,提完RNA之后,要不要测RNA浓度吗?在
: 做反转录PCR之前,要把所有RNA样品调正为同一浓度吗?
: 有人认为不用,因为在做realtime PCR的时候,有内参作对比,所以不用,但有的人还
: 是说要调正浓度,到底应不应该调正呐?
: 谢谢

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A******y
发帖数: 2041
11
A lot of people do rt-PCR badly. Let's not even talk about how many non-
linear primer in the published articles. Personally, if you are doing
relative C(t), I would always normalize my RNA/cDNA concentration just to
make sure my housekeeping gene is not moving!!!
i***l
发帖数: 1656
12
同意上面几位有具体内容的意见,补充2点,
1. 大多数的实验是要比较不同Sample中的目的基因,所以应该把各个Sample的总RNA量
调成差不多的量
2. 每个RT Kit都会对Input RNA的量有个范围规定,比如我记得Invitrogen的
SuperScript3就是2-10Ug的总RNA吧,你当然不能超出这个范围。
o******n
发帖数: 511
13
我记得我做的时候是调的。dahuzi那个回复太搞笑了。
S**********g
发帖数: 109
14
我们用的是SYBR,下次我还是测浓度吧,谢谢

7

【在 n********e 的大作中提到】
: 这个问题我遇到过。RNA 到cDNA, 不同的RNA 的浓度影响RT的效率,你可以做个
: standard curve, 用一系列浓度,包括你估计的RNA 药品的浓度(通过preliminary的
: RT pcr测) 如果你的样品差别不大,就没问题,如果你的样品浓度差别很大。有可能
: 浓度很低的样品,RT 效率也低。我遇到过。我的经验是 10^9 以上的copy number,
: 基本可以达到1 RNA 得到 1 cDNA, 但是这个浓度做qPCR 太高。如果是 10^2 - 10^7
: copy RNA 做RT,效率会很低,我最好的结果是10%。这个10%是在这个范围内一致的。
: 所以也没问题。你用的是什么RTase, Superscript III 好一点,另外加点RNAase
: inhibitor.
: 我曾经为这个RT step折腾了很久。。。后来知道,很多人都不这么做,直接拿内参。
: 。但是确实RT effeiciency在不同浓度是不一样的

S**********g
发帖数: 109
15
感谢楼上几位朋友的解答,我学到了很多东西
s**e
发帖数: 1523
16
我做得时候是调的。如果你做得样品浓度一直比较稳定,cDNA都能出来,那么时间长了
也可以省略(虽然我个人不推荐)。我那时候不光测RNA浓度调成一致,还要跑个快胶
看看提出来了没有。迅速的做rtPCR有时候是怕RNA降解。
1 (共1页)
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