f******g 发帖数: 1003 | 1 要用少量细胞,大约1000-4000个细胞,来做PCR,片段大约200bp.
请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗?
谢谢 |
i*********0 发帖数: 915 | 2 你有email么?我可以给你一个protocol。 |
w*********d 发帖数: 82 | |
D*a 发帖数: 6830 | 4 你的pcr产物要干什么?
我们genotype都不提dna,化化细胞就行了。
曾经用genotype粗消化的dna做过测序,nested pcr,很干净。 |
l***y 发帖数: 638 | 5 这个数量的细胞pcr不难,简单点的用epicentre的quickextract solution,泡泡细胞就
可以直接用来pcr
【在 f******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 要用少量细胞,大约1000-4000个细胞,来做PCR,片段大约200bp. : 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗? : 谢谢
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s**2 发帖数: 1287 | 6 genotyping时用的细胞数大概是什么数量级的?没做过,请教一下。
【在 D*a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你的pcr产物要干什么? : 我们genotype都不提dna,化化细胞就行了。 : 曾经用genotype粗消化的dna做过测序,nested pcr,很干净。
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D*a 发帖数: 6830 | 7 一片耳朵洞,消化以后还有一大片,肉眼看不出跟消化前有什么区别。
以前用老鼠尾巴,也差不多。
【在 s**2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : genotyping时用的细胞数大概是什么数量级的?没做过,请教一下。
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f******g 发帖数: 1003 | 8 测序,
【在 D*a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你的pcr产物要干什么? : 我们genotype都不提dna,化化细胞就行了。 : 曾经用genotype粗消化的dna做过测序,nested pcr,很干净。
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f******g 发帖数: 1003 | 9 谢谢了
胞就
【在 l***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个数量的细胞pcr不难,简单点的用epicentre的quickextract solution,泡泡细胞就 : 可以直接用来pcr
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D*a 发帖数: 6830 | 10 这回答,真简洁
【在 f******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 测序,
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s**2 发帖数: 1287 | 11 谢谢回答。还是估摸不出来大概多少细胞数目。
【在 D*a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 一片耳朵洞,消化以后还有一大片,肉眼看不出跟消化前有什么区别。 : 以前用老鼠尾巴,也差不多。
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f******g 发帖数: 1003 | 12 简洁,不简单
【在 D*a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这回答,真简洁
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D*a 发帖数: 6830 | 13 我也不知道啊,你大概试试吧,反正不用太多。
如果细胞少,关键是别按protocol上那样加那么多液体,少加点别把dna稀释了。
我的经验是这东西也没有规定必须怎么样
【在 s**2 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢回答。还是估摸不出来大概多少细胞数目。
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f******g 发帖数: 1003 | 14 能把你的试剂的配方或者catalog 发给我吗
谢谢
【在 D*a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你的pcr产物要干什么? : 我们genotype都不提dna,化化细胞就行了。 : 曾经用genotype粗消化的dna做过测序,nested pcr,很干净。
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D*a 发帖数: 6830 | 15 http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31538099.html
你的细胞少,少加点mix,减少一点digestion时间,比如2hours
先做做pcr 看看行不行。
pcr不行的话,一般是dna太稀了(mix加太多),或者digestion时间太长了。
用nested pcr测序
现在用的protocol是sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit Catalog Numbers XNAT2,
XNAT2R
没测过序,但是pcr带挺漂亮的。想必配方也差不多。
【在 f******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 能把你的试剂的配方或者catalog 发给我吗 : 谢谢
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f******g 发帖数: 1003 | 16 谢
,
【在 D*a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31538099.html : 你的细胞少,少加点mix,减少一点digestion时间,比如2hours : 先做做pcr 看看行不行。 : pcr不行的话,一般是dna太稀了(mix加太多),或者digestion时间太长了。 : 用nested pcr测序 : 现在用的protocol是sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit Catalog Numbers XNAT2, : XNAT2R : 没测过序,但是pcr带挺漂亮的。想必配方也差不多。
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a********k 发帖数: 2273 | 17 100细胞足够了,这是我的protocol,用genomic DNA把PCR条件摸好了基本100%成功率。
离心下细胞
加纯水20ul
用20ul枪头快速吹打20次
取2-5ul做PCR,20ul反应体系
PCR之前+95度五分钟,然后正常PCR的基础上+5cycles
Exo-SAP 30分钟,取5ul送测序。
【在 f******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 要用少量细胞,大约1000-4000个细胞,来做PCR,片段大约200bp. : 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗? : 谢谢
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w*****r 发帖数: 2061 | 18 搭车问PCR的问题,干细胞克隆筛选,几百个细胞,Viagen DirectPCR Lysis,只能P出
来几百bp的片段,1kb以上的PCR就是各种杂带,乙醇沉淀纯化也没有帮助
【在 f******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 要用少量细胞,大约1000-4000个细胞,来做PCR,片段大约200bp. : 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗? : 谢谢
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f******g 发帖数: 1003 | 19 谢谢,请问Exo-SAP什么意思?
率。
【在 a********k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 100细胞足够了,这是我的protocol,用genomic DNA把PCR条件摸好了基本100%成功率。 : 离心下细胞 : 加纯水20ul : 用20ul枪头快速吹打20次 : 取2-5ul做PCR,20ul反应体系 : PCR之前+95度五分钟,然后正常PCR的基础上+5cycles : Exo-SAP 30分钟,取5ul送测序。
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f******g 发帖数: 1003 | 20 in vivo筛选吗?
需要1k的条带吗?
【在 w*****r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 搭车问PCR的问题,干细胞克隆筛选,几百个细胞,Viagen DirectPCR Lysis,只能P出 : 来几百bp的片段,1kb以上的PCR就是各种杂带,乙醇沉淀纯化也没有帮助
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s******s 发帖数: 13035 | 21 pcr purification用的酶。一般pcr好了以后懒得纯化就要测序
的,就要加这个
【在 f******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢,请问Exo-SAP什么意思? : : 率。
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s******s 发帖数: 13035 | 22 杂带多的,用nested pcr. 大概就是先用外面一对引物p过,产物
纯化以后再用里面一对p
【在 w*****r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 搭车问PCR的问题,干细胞克隆筛选,几百个细胞,Viagen DirectPCR Lysis,只能P出 : 来几百bp的片段,1kb以上的PCR就是各种杂带,乙醇沉淀纯化也没有帮助
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f******g 发帖数: 1003 | 23 谢谢
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : pcr purification用的酶。一般pcr好了以后懒得纯化就要测序 : 的,就要加这个
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a******a 发帖数: 283 | 24 这个好酷!
我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据,应该可以吧。
不用跑胶的。
我准备照你这个条件提取DNA,加REs消化下,然后就用来做PCR,看看能不能出来数据
。做ddPCR的。貌似应该可以把。
率。
【在 a********k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 100细胞足够了,这是我的protocol,用genomic DNA把PCR条件摸好了基本100%成功率。 : 离心下细胞 : 加纯水20ul : 用20ul枪头快速吹打20次 : 取2-5ul做PCR,20ul反应体系 : PCR之前+95度五分钟,然后正常PCR的基础上+5cycles : Exo-SAP 30分钟,取5ul送测序。
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f******g 发帖数: 1003 | 25 有好结果,在这说一下,谢谢
【在 a******a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个好酷! : 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据,应该可以吧。 : 不用跑胶的。 : 我准备照你这个条件提取DNA,加REs消化下,然后就用来做PCR,看看能不能出来数据 : 。做ddPCR的。貌似应该可以把。 : : 率。
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a******a 发帖数: 283 | 26 我试了两次。一次结果和预计的差不多,10^4细胞有大约那么多的细胞基因数量测出来
;另外一次就差些,有可能丢细胞比较明显。
我的步骤就是:离心,加水20ul,p20枪头反复吸放20次,然后取3ul作pcr。
但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 :(
有没有建议?
另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA,能否使用同样protocol?有人做过吗?有
什么好的protocol吗?
这个好酷!
我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据,应该可以吧。
不用跑胶的。
我准备照你这个条件提取DNA,加REs消化下,然后就用来做PCR,看看能不能出来数据
。做ddPCR的。貌似应该可以把。
率。
【在 f******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有好结果,在这说一下,谢谢
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r******g 发帖数: 600 | |
a********k 发帖数: 2273 | 28 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol,基本成功率也是很高的。
基本类似方法
主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT
吹打破细胞
20uL加到clontech的EcoDry里面做RT
然后取4uL产物PCR
【在 a******a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个好酷! : 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据,应该可以吧。 : 不用跑胶的。 : 我准备照你这个条件提取DNA,加REs消化下,然后就用来做PCR,看看能不能出来数据 : 。做ddPCR的。貌似应该可以把。 : : 率。
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a********k 发帖数: 2273 | 29 病理组织更简单,直接加水95度,然后做PCR
如果细胞数量多,加Tris buffer+Protease K,消化1小时
100个细胞如果你液体少的话就直接1uL放PCR里面,PCR系统很牛逼的。
【在 a******a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我试了两次。一次结果和预计的差不多,10^4细胞有大约那么多的细胞基因数量测出来 : ;另外一次就差些,有可能丢细胞比较明显。 : 我的步骤就是:离心,加水20ul,p20枪头反复吸放20次,然后取3ul作pcr。 : 但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 :( : 有没有建议? : 另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA,能否使用同样protocol?有人做过吗?有 : 什么好的protocol吗? : : 这个好酷! : 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据,应该可以吧。
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a***y 发帖数: 19743 | 30 Phire direct PCR from Thermo
成功率高一点吧。普通taq可能被细胞里一些东西抑制。
【在 f******g 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 要用少量细胞,大约1000-4000个细胞,来做PCR,片段大约200bp. : 请问大家有什么好的方法吗?好的kit能推荐一下吗? : 谢谢
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f******g 发帖数: 1003 | 31 谢谢。
我这两天正在试quickExtraction solution 呢。
估计下周能看到结果
【在 a******a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我试了两次。一次结果和预计的差不多,10^4细胞有大约那么多的细胞基因数量测出来 : ;另外一次就差些,有可能丢细胞比较明显。 : 我的步骤就是:离心,加水20ul,p20枪头反复吸放20次,然后取3ul作pcr。 : 但是我的100个细胞的实验组只测到个位数的genomes数量 :( : 有没有建议? : 另外如果从活体病理组织细胞取样提取DNA,能否使用同样protocol?有人做过吗?有 : 什么好的protocol吗? : : 这个好酷! : 我准备尝试一下。我的是就是PCR最后读荧光数据,应该可以吧。
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f******g 发帖数: 1003 | 32 谢谢
【在 a********k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol,基本成功率也是很高的。 : 基本类似方法 : 主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT : 吹打破细胞 : 20uL加到clontech的EcoDry里面做RT : 然后取4uL产物PCR
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f******g 发帖数: 1003 | 33 谢谢
【在 a***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : Phire direct PCR from Thermo : 成功率高一点吧。普通taq可能被细胞里一些东西抑制。
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D*a 发帖数: 6830 | 34 那不就是我那个方子
【在 a********k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 病理组织更简单,直接加水95度,然后做PCR : 如果细胞数量多,加Tris buffer+Protease K,消化1小时 : 100个细胞如果你液体少的话就直接1uL放PCR里面,PCR系统很牛逼的。
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a******a 发帖数: 283 | 35 谢谢;)收藏了!
【在 a********k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol,基本成功率也是很高的。 : 基本类似方法 : 主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT : 吹打破细胞 : 20uL加到clontech的EcoDry里面做RT : 然后取4uL产物PCR
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a******a 发帖数: 283 | 36 像这些直接水解细胞用来做PCR的,样品稳定程度怎么样?caspases应该很容易被激活
分解掉DNA吧? |
G*******a 发帖数: 414 | 37 95C人类细胞里的酶基本上都死翘翘了吧?
【在 a******a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 像这些直接水解细胞用来做PCR的,样品稳定程度怎么样?caspases应该很容易被激活 : 分解掉DNA吧?
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a********k 发帖数: 2273 | 38 记得大多数步骤冰上操作。。。
【在 a******a 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 谢谢;)收藏了!
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d****i 发帖数: 2346 | 39
你好牛啊!这种方法稳定性如何?
96well的细胞是不是就太多了,一直想怎么样直接从96 well取细胞做realtime。现在
都是用24 well抽屉RNA,然后再做realtime。
【在 a********k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我其实还有20-100细胞做RT-PCR的protocol,基本成功率也是很高的。 : 基本类似方法 : 主要变化是19uLH2O+1uL RNaseOUT : 吹打破细胞 : 20uL加到clontech的EcoDry里面做RT : 然后取4uL产物PCR
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a******a 发帖数: 283 | 40 我做了一些,水解细胞,溶液直接加入pcr系统去。结果发现出现的都是假阳性信号。
当然我是读取taqman荧光信号来衡量pcr结果的,不是跑胶。
解释是,nucleases直接切掉probe上的fluorophores,所以出现的荧光信号都是假阳性。
那么对我来说,我这个系统(依靠读取荧光信号来判断pcr结果的)就最好先加tris
buffer和proteanse K来除掉nucleases,再水煮一下样品灭火protease K或者其他的酶
。之后加入PCR系统。
看看怎么样,这个方案可好?
【在 a********k 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 病理组织更简单,直接加水95度,然后做PCR : 如果细胞数量多,加Tris buffer+Protease K,消化1小时 : 100个细胞如果你液体少的话就直接1uL放PCR里面,PCR系统很牛逼的。
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