e********r 发帖数: 147 | 1 正在研究一个细胞膜受体,胞外区与胞内区连接处只有17个aa,预测是一段alpha序列。
受到 ligand 刺激后,这段序列的螺旋度可能发生变构反应,激活胞内区的激酶活性。
因为是膜蛋白,做3D结构是不现实的,俺们也不懂。请问用什么样的生物化学或遗传学
方法可以证明这个肽段是alpha序列,并且会变构。看文献有些是在前面连一个coiled-
coil序列,有木有更直接一些的方法? |
s******y 发帖数: 28562 | 2 如果你不想知道具体结构,只想知道是不是alpha helix 的话,
貌似可以用红外旋光法circular dichroism? 我的记忆中这个好像是可以放在有机溶液
里面测的,所以可以大致的模拟膜的分子条件。
http://en.wikipedia.org/wiki/Circular_dichroism
http://en.wikipedia.org/wiki/Vibrational_circular_dichroism
你说的那个变构,如果指的是膜外面的变构比较容易一些,但是如果是指膜里面的变构
则比较麻烦,需要根据具体的序列来设计比较微妙的实验。比方说,可以用荧光标记法
,把肽链上一个很靠近膜(但是不是在膜里面!)的残基的侧链标上荧光。然后如果膜
里面的序列变构了,一般都会影响到在膜里面走的序列的长度,就一般都会使得那个刚
好在膜外的残基要么就是离膜更近了要么就是更远了,反正一般都会使得荧光产生变化
, 因为荧光分子和hydrophobic surface (lipid etc.)的距离会影响荧光强度甚至波长。
coiled-
【在 e********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 正在研究一个细胞膜受体,胞外区与胞内区连接处只有17个aa,预测是一段alpha序列。 : 受到 ligand 刺激后,这段序列的螺旋度可能发生变构反应,激活胞内区的激酶活性。 : 因为是膜蛋白,做3D结构是不现实的,俺们也不懂。请问用什么样的生物化学或遗传学 : 方法可以证明这个肽段是alpha序列,并且会变构。看文献有些是在前面连一个coiled- : coil序列,有木有更直接一些的方法?
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p****s 发帖数: 3153 | 3 你所谓的alpha序列是指alpha helix么?一般来说如果在膜内只有一个跨膜域的蛋白,
并且是单体,跨膜域只能是alpha helix。想直接证明可能需要生物物理方法,例如NMR
, EPR或者FRET什么的。变构是什么意思?好像RTK之类的蛋白是由于二聚被激活呀。
coiled-
【在 e********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 正在研究一个细胞膜受体,胞外区与胞内区连接处只有17个aa,预测是一段alpha序列。 : 受到 ligand 刺激后,这段序列的螺旋度可能发生变构反应,激活胞内区的激酶活性。 : 因为是膜蛋白,做3D结构是不现实的,俺们也不懂。请问用什么样的生物化学或遗传学 : 方法可以证明这个肽段是alpha序列,并且会变构。看文献有些是在前面连一个coiled- : coil序列,有木有更直接一些的方法?
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p****s 发帖数: 3153 | 4 这倒提醒我了,也许可以直接用Tryptophan荧光,应该可以反映构象变化
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果你不想知道具体结构,只想知道是不是alpha helix 的话, : 貌似可以用红外旋光法circular dichroism? 我的记忆中这个好像是可以放在有机溶液 : 里面测的,所以可以大致的模拟膜的分子条件。 : http://en.wikipedia.org/wiki/Circular_dichroism : http://en.wikipedia.org/wiki/Vibrational_circular_dichroism : 你说的那个变构,如果指的是膜外面的变构比较容易一些,但是如果是指膜里面的变构 : 则比较麻烦,需要根据具体的序列来设计比较微妙的实验。比方说,可以用荧光标记法 : ,把肽链上一个很靠近膜(但是不是在膜里面!)的残基的侧链标上荧光。然后如果膜 : 里面的序列变构了,一般都会影响到在膜里面走的序列的长度,就一般都会使得那个刚 : 好在膜外的残基要么就是离膜更近了要么就是更远了,反正一般都会使得荧光产生变化
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d********n 发帖数: 15 | 5 楼主这种思路下去,就已经有走向千老不归路的倾向了。
1. 就算其他区域发生构想变化,也会带动该区域变化。而且可以想的出来这肯定多说
有变化的。问题是花你宝贵的时间和有限的funding解决这个问题,值得么?
2. 看看人类有没有什么疾病与该区域或该protein有关
3. 看看该区域有没有很多的snp,如果太多,很可能说明它对该区域功能不是太重要,
或即使真个protein功能丧失对整个细胞和人体无关紧要。
当然,除非这个protein knockout的phenotype非常明显,或者是目前相当热的一个
protein,否则楼主还是找的别的project好。具体再聊。 |
s**2 发帖数: 1287 | 6 哥们儿你太sharp了!
【在 d********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 楼主这种思路下去,就已经有走向千老不归路的倾向了。 : 1. 就算其他区域发生构想变化,也会带动该区域变化。而且可以想的出来这肯定多说 : 有变化的。问题是花你宝贵的时间和有限的funding解决这个问题,值得么? : 2. 看看人类有没有什么疾病与该区域或该protein有关 : 3. 看看该区域有没有很多的snp,如果太多,很可能说明它对该区域功能不是太重要, : 或即使真个protein功能丧失对整个细胞和人体无关紧要。 : 当然,除非这个protein knockout的phenotype非常明显,或者是目前相当热的一个 : protein,否则楼主还是找的别的project好。具体再聊。
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s******y 发帖数: 28562 | 7 有一定道理。但是看楼主问的样子,有可能是这个蛋白已经是他们实验室已经做了不少
工作的了,应该是已经确定和疾病有关的了。
【在 d********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 楼主这种思路下去,就已经有走向千老不归路的倾向了。 : 1. 就算其他区域发生构想变化,也会带动该区域变化。而且可以想的出来这肯定多说 : 有变化的。问题是花你宝贵的时间和有限的funding解决这个问题,值得么? : 2. 看看人类有没有什么疾病与该区域或该protein有关 : 3. 看看该区域有没有很多的snp,如果太多,很可能说明它对该区域功能不是太重要, : 或即使真个protein功能丧失对整个细胞和人体无关紧要。 : 当然,除非这个protein knockout的phenotype非常明显,或者是目前相当热的一个 : protein,否则楼主还是找的别的project好。具体再聊。
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e********r 发帖数: 147 | 8 哇,好专业,谢谢!但不知红外旋光法circular dichroism是否能够在整个蛋白构象中
,就只识别这17个aa的构象。另外,这17个aa正好是在膜外面,最靠近胞质的地方,我
想你说的荧光标记法应该可以试试。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果你不想知道具体结构,只想知道是不是alpha helix 的话, : 貌似可以用红外旋光法circular dichroism? 我的记忆中这个好像是可以放在有机溶液 : 里面测的,所以可以大致的模拟膜的分子条件。 : http://en.wikipedia.org/wiki/Circular_dichroism : http://en.wikipedia.org/wiki/Vibrational_circular_dichroism : 你说的那个变构,如果指的是膜外面的变构比较容易一些,但是如果是指膜里面的变构 : 则比较麻烦,需要根据具体的序列来设计比较微妙的实验。比方说,可以用荧光标记法 : ,把肽链上一个很靠近膜(但是不是在膜里面!)的残基的侧链标上荧光。然后如果膜 : 里面的序列变构了,一般都会影响到在膜里面走的序列的长度,就一般都会使得那个刚 : 好在膜外的残基要么就是离膜更近了要么就是更远了,反正一般都会使得荧光产生变化
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e********r 发帖数: 147 | 9 唔,这17个aa不在tansmembrane helix里头,而是正好在膜向着胞质的那一头。这个受
体形成dimer是天生的,我们怀疑17个aa形成的helix可能在识别到ligand后,会扭得更
厉害。
NMR
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你所谓的alpha序列是指alpha helix么?一般来说如果在膜内只有一个跨膜域的蛋白, : 并且是单体,跨膜域只能是alpha helix。想直接证明可能需要生物物理方法,例如NMR : , EPR或者FRET什么的。变构是什么意思?好像RTK之类的蛋白是由于二聚被激活呀。 : : coiled-
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e********r 发帖数: 147 | 10 兄弟,你这段话让我等泪奔如江河啊,呵呵。
不归路是木有办法了,因为这个蛋白在我们这个小领域里还是很重要的一个明星分子,
当然,是小领域......。
【在 d********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 楼主这种思路下去,就已经有走向千老不归路的倾向了。 : 1. 就算其他区域发生构想变化,也会带动该区域变化。而且可以想的出来这肯定多说 : 有变化的。问题是花你宝贵的时间和有限的funding解决这个问题,值得么? : 2. 看看人类有没有什么疾病与该区域或该protein有关 : 3. 看看该区域有没有很多的snp,如果太多,很可能说明它对该区域功能不是太重要, : 或即使真个protein功能丧失对整个细胞和人体无关紧要。 : 当然,除非这个protein knockout的phenotype非常明显,或者是目前相当热的一个 : protein,否则楼主还是找的别的project好。具体再聊。
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e********r 发帖数: 147 | 11 是滴,这是个细菌滴信号蛋白已经被研究了30年了,有很多工作放在前头。最关键的一
点,是它调控quorum sensing过程,细菌领域里头的大热门,所以我们正在折腾它,呵
呵。
您的意思是不是:这么做已经做得太细了?
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 有一定道理。但是看楼主问的样子,有可能是这个蛋白已经是他们实验室已经做了不少 : 工作的了,应该是已经确定和疾病有关的了。
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s******y 发帖数: 28562 | 12 如果你打算用CD spectra的话,直接化学合成那一小段肽链即可。最好不要看看整个的
蛋白。而且你这个蛋白如果是过膜蛋白的话提纯起来可不是一般的麻烦。
【在 e********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 哇,好专业,谢谢!但不知红外旋光法circular dichroism是否能够在整个蛋白构象中 : ,就只识别这17个aa的构象。另外,这17个aa正好是在膜外面,最靠近胞质的地方,我 : 想你说的荧光标记法应该可以试试。
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s******y 发帖数: 28562 | 13 细不细只有你以及你老板最清楚。
既然你们很确认这个蛋白是很重要的蛋白,而且你说的那段肽链的构型和蛋白的功能能
很有可能有关的话,那就放手大胆的去做吧。
【在 e********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 是滴,这是个细菌滴信号蛋白已经被研究了30年了,有很多工作放在前头。最关键的一 : 点,是它调控quorum sensing过程,细菌领域里头的大热门,所以我们正在折腾它,呵 : 呵。 : 您的意思是不是:这么做已经做得太细了?
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e********r 发帖数: 147 | 14 你说的对,我们可以合成这段小肽然后用CD试试。不过这么做还不能解决前面的跨膜区
感应到ligand后,信号传过来如何改变它的构象这个核心问题。这个如何破?另外,我
就是我的老板,呵呵......
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 如果你打算用CD spectra的话,直接化学合成那一小段肽链即可。最好不要看看整个的 : 蛋白。而且你这个蛋白如果是过膜蛋白的话提纯起来可不是一般的麻烦。
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s******y 发帖数: 28562 | 15 靠!如果你就是老板的话那我可要收咨询费了!呵呵。
关于你说的“跨膜区感应到ligand后,信号传过来如何改变它的构象”这个问题我不是
很明白。
你说的这段17 Aa 肽链到底是在细胞内还是细胞外?
【在 e********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你说的对,我们可以合成这段小肽然后用CD试试。不过这么做还不能解决前面的跨膜区 : 感应到ligand后,信号传过来如何改变它的构象这个核心问题。这个如何破?另外,我 : 就是我的老板,呵呵......
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n***y 发帖数: 114 | 16 按你的要求,只能用这个蛋白的胞外区跨膜区17aa来验证你的假设。CD只能告诉你
alpha-helix,beta-sheet等在整个蛋白中的比例,你加入ligand后,17aa假设有变化,
在整个蛋白和ligand(如果是蛋白的话,就算是其他的chemical可能也有影响)在CD的
变化中,你也不能说变化就是这17aa的。
你可以找个Cryo-EM看看。 |
q******g 发帖数: 3858 | 17 我怎么觉得你说的这个方向才是不归路呢?
人家只是做基础研究,对某个蛋白感兴趣而已。不一定所有的研究都要和疾病有关阿。
【在 d********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 楼主这种思路下去,就已经有走向千老不归路的倾向了。 : 1. 就算其他区域发生构想变化,也会带动该区域变化。而且可以想的出来这肯定多说 : 有变化的。问题是花你宝贵的时间和有限的funding解决这个问题,值得么? : 2. 看看人类有没有什么疾病与该区域或该protein有关 : 3. 看看该区域有没有很多的snp,如果太多,很可能说明它对该区域功能不是太重要, : 或即使真个protein功能丧失对整个细胞和人体无关紧要。 : 当然,除非这个protein knockout的phenotype非常明显,或者是目前相当热的一个 : protein,否则楼主还是找的别的project好。具体再聊。
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d******1 发帖数: 709 | 18 CD, FRET,对于这么小的区域,基本没戏, resolution没有那么高。
这个最简单的就是用NMR,找个熟悉的实验室,半年出结果。
coiled-
【在 e********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 正在研究一个细胞膜受体,胞外区与胞内区连接处只有17个aa,预测是一段alpha序列。 : 受到 ligand 刺激后,这段序列的螺旋度可能发生变构反应,激活胞内区的激酶活性。 : 因为是膜蛋白,做3D结构是不现实的,俺们也不懂。请问用什么样的生物化学或遗传学 : 方法可以证明这个肽段是alpha序列,并且会变构。看文献有些是在前面连一个coiled- : coil序列,有木有更直接一些的方法?
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p****s 发帖数: 3153 | 19 关键还是膜蛋白,也许要用固相NMR?
【在 d******1 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : CD, FRET,对于这么小的区域,基本没戏, resolution没有那么高。 : 这个最简单的就是用NMR,找个熟悉的实验室,半年出结果。 : : coiled-
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d******1 发帖数: 709 | 20 08和09年,有一个俄国的实验,连续发了3-4片JBC, JMB, BiophysicalJournal 文
章解析single transmembrane helix of Eph A4, ErbB2 and others 的文章,he
solved the monomeric and dimeric structures of these proteins.基本上半年一片
。而且实验花费极少 (俄国毕竟没钱)。 现在6年过去了,这种实验只会越来越简单
。
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 关键还是膜蛋白,也许要用固相NMR?
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d******1 发帖数: 709 | 21 液相NMR
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 关键还是膜蛋白,也许要用固相NMR?
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p****s 发帖数: 3153 | 22 太难,如果总分子量超过25 kDa就很难做了。如果用detergent能不能模拟体内环境又
有问题
【在 d******1 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 液相NMR
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d******1 发帖数: 709 | 23 08和09年,有一个俄国的实验,连续发了3-4片JBC, JMB, BiophysicalJournal 文
章解析single transmembrane helix of Eph A4, ErbB2 and others 的文章,he
solved the monomeric and dimeric structures of these proteins.基本上半年一片
。而且实验花费极少 (俄国毕竟没钱)。 现在6年过去了,这种实验只会越来越简单
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 太难,如果总分子量超过25 kDa就很难做了。如果用detergent能不能模拟体内环境又 : 有问题
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e********r 发帖数: 147 | 24 这段肽段是在胞质内,但其N端紧接着transmembrane region。C端紧接着kinase
domain。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 靠!如果你就是老板的话那我可要收咨询费了!呵呵。 : 关于你说的“跨膜区感应到ligand后,信号传过来如何改变它的构象”这个问题我不是 : 很明白。 : 你说的这段17 Aa 肽链到底是在细胞内还是细胞外?
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e********r 发帖数: 147 | 25 你说得太清楚了,涨了不少姿势。不过,Cryo-EM太高大上了,能否就用遗传或生化的
方法搞搞再说?
【在 n***y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 按你的要求,只能用这个蛋白的胞外区跨膜区17aa来验证你的假设。CD只能告诉你 : alpha-helix,beta-sheet等在整个蛋白中的比例,你加入ligand后,17aa假设有变化, : 在整个蛋白和ligand(如果是蛋白的话,就算是其他的chemical可能也有影响)在CD的 : 变化中,你也不能说变化就是这17aa的。 : 你可以找个Cryo-EM看看。
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e********r 发帖数: 147 | 26 NMR是好,但结构的东东,用在我们这类蛋白上基本同戏,这个要搞早有人整出来了,
可能方法上还是有难度滴。
【在 d******1 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : CD, FRET,对于这么小的区域,基本没戏, resolution没有那么高。 : 这个最简单的就是用NMR,找个熟悉的实验室,半年出结果。 : : coiled-
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e********r 发帖数: 147 | 27 同意,全长有78 kd。不过我们已经构建了这个受体激酶全长的proteoliposome,激酶活
性还相当不错。不过这玩意毕竟是的nano颗粒,结构生物学的方法不好使啊.....正因
如此,想能否用遗传或生化的方法解决。NMR, X ray,Cryo EM感脚难度过大,也不懂。
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 太难,如果总分子量超过25 kDa就很难做了。如果用detergent能不能模拟体内环境又 : 有问题
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p****s 发帖数: 3153 | 28 用间接证据也行,alanine scanning吧,算是遗传和生化的结合,起码能知道重要的位
点有哪些。(不过没人做过么?)
【在 e********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你说得太清楚了,涨了不少姿势。不过,Cryo-EM太高大上了,能否就用遗传或生化的 : 方法搞搞再说?
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p****s 发帖数: 3153 | 29 哈哈,居然已经做到这种程度了啊。Cryo EM对你来说分辨率太低了,17个氨基酸估计
最多也就2 nm,很难看出差别。如果你预测有构象能导致距离变化的话,也许可以用
EPR,但是需要修饰。
【在 e********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 同意,全长有78 kd。不过我们已经构建了这个受体激酶全长的proteoliposome,激酶活 : 性还相当不错。不过这玩意毕竟是的nano颗粒,结构生物学的方法不好使啊.....正因 : 如此,想能否用遗传或生化的方法解决。NMR, X ray,Cryo EM感脚难度过大,也不懂。
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p****s 发帖数: 3153 | 30 查了一下,那个只是TM domain。楼主想做的是全长蛋白中的其中一段,而且不是
integral transmembrane的部分,真正的结构什么样很难预测。
【在 d******1 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 08和09年,有一个俄国的实验,连续发了3-4片JBC, JMB, BiophysicalJournal 文 : 章解析single transmembrane helix of Eph A4, ErbB2 and others 的文章,he : solved the monomeric and dimeric structures of these proteins.基本上半年一片 : 。而且实验花费极少 (俄国毕竟没钱)。 现在6年过去了,这种实验只会越来越简单
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e********r 发帖数: 147 | 31 唔,这个我们也在想,其实不难,17个aa一会儿就突掉了,里面还确实没有影响alpha
helix的那几种氨基酸,比如Pro, Gly什么的。所以我们在想如果把关键位点突成P或G
,一定会破坏alpha helix,得到loss of function的结果。但能不能有目的地突成别
的氨基酸,从而获得gain of function的突变体呢(比如不加ligand就能得到很高的激
酶活性,这个酶活我们能检测)?怎么做突变更显得有智慧?呵呵。
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用间接证据也行,alanine scanning吧,算是遗传和生化的结合,起码能知道重要的位 : 点有哪些。(不过没人做过么?)
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e********r 发帖数: 147 | 32 谢谢哈,我去查一查您说的EPR是啥子东东.....回家了,明天再看。
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 哈哈,居然已经做到这种程度了啊。Cryo EM对你来说分辨率太低了,17个氨基酸估计 : 最多也就2 nm,很难看出差别。如果你预测有构象能导致距离变化的话,也许可以用 : EPR,但是需要修饰。
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p****s 发帖数: 3153 | 33 在膜表面的话可以每隔3-4个氨基酸引入一个带电的氨基酸我猜?可以跟磷脂形成相互
作用
alpha
G
【在 e********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 唔,这个我们也在想,其实不难,17个aa一会儿就突掉了,里面还确实没有影响alpha : helix的那几种氨基酸,比如Pro, Gly什么的。所以我们在想如果把关键位点突成P或G : ,一定会破坏alpha helix,得到loss of function的结果。但能不能有目的地突成别 : 的氨基酸,从而获得gain of function的突变体呢(比如不加ligand就能得到很高的激 : 酶活性,这个酶活我们能检测)?怎么做突变更显得有智慧?呵呵。
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d******1 发帖数: 709 | 34 这样,除了间接的方法,就只有长晶体结构了。 78Kda的蛋白做EM,观察17AA的片段。
很容易看不见。
剩下的方法就只能用ala or cys screening 和外接coiled coil了。 然后猜一下,看
看是不是和其他实验吻合。
【在 p****s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 查了一下,那个只是TM domain。楼主想做的是全长蛋白中的其中一段,而且不是 : integral transmembrane的部分,真正的结构什么样很难预测。
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d******1 发帖数: 709 | 35 你应该是想看jurtamembrane domain的功能。 John Kuriyan, 2010还是2011年有一片
关于jurtamembrane domain激活her2 kinase domain的science还是cell的文章。可以
参考一下。
【在 e********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : NMR是好,但结构的东东,用在我们这类蛋白上基本同戏,这个要搞早有人整出来了, : 可能方法上还是有难度滴。
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s******y 发帖数: 28562 | 36 这样子的啊,你早说清楚啊!我还以为你说的是这段17Aa 贯穿membrane 一部分在外一
部分在内呢!所以我上面建议的有机溶剂里的CD spectra 以及大家建议的固相NMR其实
都是针对过膜的片段的。你研究的那段序列如果都是在细胞质内部的话我们给你的建议
会有很大的不同。
首先,既然是在细胞内部的,那么大致应该是一个水溶性的片段。所以如果要看构相是
不是一个alpha-helix 的话,直接把那一段17个氨基酸找公司合成了然后直接用一般
的水相NMR即可。这个是非常简单的活。随便找个做结构的实验室或者core facility帮
一下忙即可。说不定某些公司都能帮你做。如果你仅仅是想简单看看是不是alpha-
helix也行,非常简单的CD spectra也行,很多大学的open access core facility 都
能做,只不过不能告诉你特别具体的结构而已。
但是你要看那个结构的变化这个比较伤脑筋。不要往冷冻电镜动心思了,目前的分析度
没有那么高,而且对动态变化的分析很麻烦的。
而且因为你要看膜外的部位对膜内的部位的影响,这个是一个很麻烦的问题。最直接的
答案是暴力上膜蛋白结晶,带ligand 以及不带ligand来进行对比。但是很多膜蛋白都
是很难对付的。我看你的实验室大概也没有这个能力。
目前要回答这种问题,如果没有能力直接回答的话就只好间接回答。常见的方法是搞一
个recombinant protein, 把kinase 那部分去掉换成不同的reporter(比方说荧光蛋白
)来推测那一段17Aa的构型变化。或者把你那一段17Aa序列里最靠近膜的残基换成
tryptophan之类的有intrinsic fluorescence 的氨基酸, 然后看看外面的受体结合
ligand之后是否会导致tryptophan的自发荧光增强或者减弱。
【在 e********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这段肽段是在胞质内,但其N端紧接着transmembrane region。C端紧接着kinase : domain。
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t****x 发帖数: 1429 | 37 solution nmr 做这种小peptide还是很猛的
不知道你做的和下面这篇文章是不是比较类似的东西
(Regulation of T Cell Receptor Activation by Dynamic Membrane Binding of
the CD3ɛ Cytoplasmic Tyrosine-Based Motif) |
e********r 发帖数: 147 | 38 热情感谢胖头鱼提这么多建议。在结构方便我们绝对是小白,所以才想着用生化或遗传
的方法来试一下。你说的Try标记我们准备先做一下再看,希望能够看到有意思的结果。
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这样子的啊,你早说清楚啊!我还以为你说的是这段17Aa 贯穿membrane 一部分在外一 : 部分在内呢!所以我上面建议的有机溶剂里的CD spectra 以及大家建议的固相NMR其实 : 都是针对过膜的片段的。你研究的那段序列如果都是在细胞质内部的话我们给你的建议 : 会有很大的不同。 : 首先,既然是在细胞内部的,那么大致应该是一个水溶性的片段。所以如果要看构相是 : 不是一个alpha-helix 的话,直接把那一段17个氨基酸找公司合成了然后直接用一般 : 的水相NMR即可。这个是非常简单的活。随便找个做结构的实验室或者core facility帮 : 一下忙即可。说不定某些公司都能帮你做。如果你仅仅是想简单看看是不是alpha- : helix也行,非常简单的CD spectra也行,很多大学的open access core facility 都 : 能做,只不过不能告诉你特别具体的结构而已。
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