Biology版 - 谈谈和蛋白打交道的日子 （五）Tag! You’re it. |
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c********n
发帖数: 225 | 1 第五篇 Tag! You’re it.
这篇回顾一下用His-tag纯化蛋白带来的一些花絮。
每个蛋白都有自己的脾气，所以表达和纯化他们其实就有点像cooking，从原材料的准
备，配方到调味，把握火候，最后色香味俱全才可能成为一道佳肴 – 对于蛋白就是要
达到有其对应的生物活性了。每每看到“保证型”蛋白表达服务的宣传，心里笑一下，
然后就会想到自己的一个“秘密武器” – 有一个融合蛋白确实可以达到几乎100%的高
效表达， 只是都在包涵体里。从另一方面来讲，如果没有时间和经费的限制，确实每
一个蛋白只要花功夫去做，最后都能达到100%成功率,得到有生物活性的终产物。
大部分人的时间和经费都有限，也不是每一个人都有耐心或有必要成为大厨， 那么就
有了purification tag。 His-tag是个经典。说起Histidine这个氨基酸，它的
imidazole side chain的pKa在6左右，这个特性让Histidine成为很多酶的活性中心的
一个重要组分， 这方面这次就不多讲了；另一方面，histidine也是个很好的metal
chelator， 是很多metalloprotein的一个必须， 这个特性也造就了 His-tag这个方便
的蛋白纯化工具。
大多数His-tag纯化树脂都用到Nickel。这个metal ion一方面chelate在树脂上，另一
方面结合His-tag。其实树脂和His-tag之间相对于Nickel是动态竞争关系，如果想更好
的结合His-tag protein， Nickel的 chelating site就要对蛋白exposed的多一些，那
么Nickel随着蛋白一起脱离树脂的几率也就增大，因而不可避免就会有Nickel
contaminated His-tag protein的现象。下面就描述一下两个extreme的例子。
第一个例子是个function unknown的hypothetical DNA binding protein。
这是个pI很高，十几个kDa的蛋白，在pH 7是highly positively charged， 适合于
binding negatively charged DNA。用His-tag在E. coli 里面表达量很高，NMR 15N
HSQC检测证明是fully folded， 可是非常奇怪的是，有将近三分之一的HSQC peak是看
不到的；而用其他方法（质谱和蛋白胶）检测到的都是全长蛋白，那么HSQC peak藏到
哪里去了？
含有paramagnetic metal的蛋白会导致一些NMR峰从正常区域里消失，而His-tag
chelates Nickel，这是否会是症结？于是送样品去做ICP-MS检测metal的含量，确实非
常明显的含有Nickel。症结找到了，随后做实验去除Nickel。简单的在样品里加入EDTA
无法让隐藏的peaks现身，只有用高浓度EDTA做overnight dialysis处理后， 整个蛋白
的图谱才完整出现。还好，这个蛋白不是metalloprotein，不然这么大量的EDTA会让它
失活的。
不是每一个His-tag提纯的蛋白都会有这个现象的。即使有Nickel contamination，也
不会像这个蛋白一样，由于His-tag本身的charge以及可能mimic DNA的缘故， 使得His
-tag -Nickel和蛋白结合的很紧密。
第二个例子是个IgG binding protein
这个蛋白pI很低，在pH 7是negatively charged。同样，用His-tag在E. coli 里面表
达量很高，纯化后检测的活性也很高。从1L里提取的蛋白颜色有点微黄， 没有在意，
就scale up到10L提取。蛋白浓度很高，可是有着light beer的黄褐色， 加入储藏必须
用的DTT以后更是变为dark beer的深褐色！而蛋白本身不含可能使其有颜色的metal或
者其他co-factor， 那么这个颜色是什么？
有一个2000年的patent是快速colorimetric方法在蛋白溶液里检测Nickel和cobalt，就
是用的DTT和phosphate buffer。那么这个深褐色不会又是Nickel吧？是的，同样ICP-
MS可以在样品里检测到大量的Nickel，同样去除Nickel又不是件容易的事。幸好这个蛋
白是热稳定的， 加入大量的EDTA高温处理，再dialysis，蛋白就会成为本来应有的无
色透明状态， 并保持高活性。
这第二个例子让我常常想，那么其他negatively charged蛋白，用Nickel column 大量
纯化后，会不会也有这种啤酒的颜色呢？
以上两个例子都很extreme。只有extreme的经历以后才会感触很深。如果你的Nickel
resin纯化出的His-tag蛋白有点异常， 不妨用ICP-MS去检测一下metal的含量。
就像经典的Tag游戏，被tag了，遇到问题了，就按游戏规则找解决方案吧。
-CoinByCoin
May 4th,2014 | a****d
发帖数: 1919 | | w*****1
发帖数: 414 | | b******y
发帖数: 627 | | s*****g
发帖数: 7857 | 5 先顶，再看！
【在 c********n 的大作中提到】
: 第五篇 Tag! You’re it.
: 这篇回顾一下用His-tag纯化蛋白带来的一些花絮。
: 每个蛋白都有自己的脾气，所以表达和纯化他们其实就有点像cooking，从原材料的准
: 备，配方到调味，把握火候，最后色香味俱全才可能成为一道佳肴 – 对于蛋白就是要
: 达到有其对应的生物活性了。每每看到“保证型”蛋白表达服务的宣传，心里笑一下，
: 然后就会想到自己的一个“秘密武器” – 有一个融合蛋白确实可以达到几乎100%的高
: 效表达， 只是都在包涵体里。从另一方面来讲，如果没有时间和经费的限制，确实每
: 一个蛋白只要花功夫去做，最后都能达到100%成功率,得到有生物活性的终产物。
: 大部分人的时间和经费都有限，也不是每一个人都有耐心或有必要成为大厨， 那么就
: 有了purification tag。 His-tag是个经典。说起Histidine这个氨基酸，它的
| W***o
发帖数: 6519 | 6 干一行喜欢一行最重要，别管钱多钱少，喜欢，有定力就好！
ps：楼主说的这些我当年也作过很多，提蛋白有几次需要养20L的细菌摇过夜，蛋白提
纯以后没有活性，还得用tev把his tag切掉，再过sizing column, 总之非常的
frustrating，不是很enjoy那样的生活
【在 c********n 的大作中提到】
: 第五篇 Tag! You’re it.
: 这篇回顾一下用His-tag纯化蛋白带来的一些花絮。
: 每个蛋白都有自己的脾气，所以表达和纯化他们其实就有点像cooking，从原材料的准
: 备，配方到调味，把握火候，最后色香味俱全才可能成为一道佳肴 – 对于蛋白就是要
: 达到有其对应的生物活性了。每每看到“保证型”蛋白表达服务的宣传，心里笑一下，
: 然后就会想到自己的一个“秘密武器” – 有一个融合蛋白确实可以达到几乎100%的高
: 效表达， 只是都在包涵体里。从另一方面来讲，如果没有时间和经费的限制，确实每
: 一个蛋白只要花功夫去做，最后都能达到100%成功率,得到有生物活性的终产物。
: 大部分人的时间和经费都有限，也不是每一个人都有耐心或有必要成为大厨， 那么就
: 有了purification tag。 His-tag是个经典。说起Histidine这个氨基酸，它的
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