j****x 发帖数: 1704 | 1 想构建一个单载体诱导表达系统single-vector Tet-inducible lentivector,类似
clonetech的Tet-One system(据称是目前唯一的商品化载体),但是手头的载体系统
都是基于Invitrogen的pLenti系列的,不太想再换clonetech的kit了。
不知道有没有人基于pLenti载体构建过这种single-vector Tet-on系统,或者知道是否
可以在Addgene上找到类似的质粒。理论上讲,合成Tet-one上个那段包含Tet-on-3G以
及pTRE3GS-MCS的cassette然后置换掉pLenti载体上相应的区域即可。如果有人有经验可
以指点,非常感谢! |
j****x 发帖数: 1704 | 2 类似这个载体
验可
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想构建一个单载体诱导表达系统single-vector Tet-inducible lentivector,类似 : clonetech的Tet-One system(据称是目前唯一的商品化载体),但是手头的载体系统 : 都是基于Invitrogen的pLenti系列的,不太想再换clonetech的kit了。 : 不知道有没有人基于pLenti载体构建过这种single-vector Tet-on系统,或者知道是否 : 可以在Addgene上找到类似的质粒。理论上讲,合成Tet-one上个那段包含Tet-on-3G以 : 及pTRE3GS-MCS的cassette然后置换掉pLenti载体上相应的区域即可。如果有人有经验可 : 以指点,非常感谢!
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a****d 发帖数: 1919 | 3 http://www.addgene.org/43914/
这个gateway vector行不?包装用三代的包装质粒就行,addgene上面有全部的包装系
统。
验可
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想构建一个单载体诱导表达系统single-vector Tet-inducible lentivector,类似 : clonetech的Tet-One system(据称是目前唯一的商品化载体),但是手头的载体系统 : 都是基于Invitrogen的pLenti系列的,不太想再换clonetech的kit了。 : 不知道有没有人基于pLenti载体构建过这种single-vector Tet-on系统,或者知道是否 : 可以在Addgene上找到类似的质粒。理论上讲,合成Tet-one上个那段包含Tet-on-3G以 : 及pTRE3GS-MCS的cassette然后置换掉pLenti载体上相应的区域即可。如果有人有经验可 : 以指点,非常感谢!
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T****u 发帖数: 424 | 4 https://www.addgene.org/21915/
这个就是pLKO-tetON
据说因为Clonetech 抗议,改成了 Tet-pLKO-puro
不用谢,我叫雷锋。
验可
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想构建一个单载体诱导表达系统single-vector Tet-inducible lentivector,类似 : clonetech的Tet-One system(据称是目前唯一的商品化载体),但是手头的载体系统 : 都是基于Invitrogen的pLenti系列的,不太想再换clonetech的kit了。 : 不知道有没有人基于pLenti载体构建过这种single-vector Tet-on系统,或者知道是否 : 可以在Addgene上找到类似的质粒。理论上讲,合成Tet-one上个那段包含Tet-on-3G以 : 及pTRE3GS-MCS的cassette然后置换掉pLenti载体上相应的区域即可。如果有人有经验可 : 以指点,非常感谢!
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Z******5 发帖数: 435 | 5 我最近也在为这事折腾呢。
我们最近买了pLKO-Tet-on,表达shRNA非常好用。整个载体10k多一点。插入shRNA后载
体也不会太大。
也考虑把这个载体promoter改成表达蛋白的,但是如果插入蛋白表达基因就会很大。最
近还在纠结中。 |
T****u 发帖数: 424 | 6 包装效率低
【在 Z******5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近也在为这事折腾呢。 : 我们最近买了pLKO-Tet-on,表达shRNA非常好用。整个载体10k多一点。插入shRNA后载 : 体也不会太大。 : 也考虑把这个载体promoter改成表达蛋白的,但是如果插入蛋白表达基因就会很大。最 : 近还在纠结中。
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j****x 发帖数: 1704 | 7 多谢诸位!
查了下前面给出的Addgene上的载体,感觉不是特别合适(表达shRNA和mRNA有一个很关
键的差别),最后还是决定自己手动改造了。根据Clonetech的pLVX-TetOne载体合成一
段大约3kb的cassette,置换到pLenti载体的backbone上,不含插入gene的话大概是9kb
,这样表达2kb以下的ORF应该问题不大,更大的插入就像铁牛所说,要严重影响包装效
率了。 |
x*****e 发帖数: 309 | 8 Plasmid 20321: TetO-FUW-OSKM , 我觉得这个挺好的,用PCR替换OSKM成自己
要表达的蛋白,刚刚订了个,试试看。
【在 Z******5 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 我最近也在为这事折腾呢。 : 我们最近买了pLKO-Tet-on,表达shRNA非常好用。整个载体10k多一点。插入shRNA后载 : 体也不会太大。 : 也考虑把这个载体promoter改成表达蛋白的,但是如果插入蛋白表达基因就会很大。最 : 近还在纠结中。
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m*****z 发帖数: 1451 | 9 all in one的lenti载体最致命的就是表达基因的长度有限,太长了会大大影响滴度。
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 类似这个载体 : : 验可
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m*****z 发帖数: 1451 | 10 那个公司会给你合成TRE3G promoter啊?里面有7个TRE repeat,合成难度很大哦。
9kb
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 多谢诸位! : 查了下前面给出的Addgene上的载体,感觉不是特别合适(表达shRNA和mRNA有一个很关 : 键的差别),最后还是决定自己手动改造了。根据Clonetech的pLVX-TetOne载体合成一 : 段大约3kb的cassette,置换到pLenti载体的backbone上,不含插入gene的话大概是9kb : ,这样表达2kb以下的ORF应该问题不大,更大的插入就像铁牛所说,要严重影响包装效 : 率了。
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j****x 发帖数: 1704 | 11 你说的没错,这类载体的插入片段大小非常受限,一旦超过2.5kb就很难包装了,如果
把WPRE等其他非必需element删除的话,大致包装极限能到3.5kb的样子。
能合成复杂重复序列的公司还是有的,稍微贵点儿而已。
【在 m*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 那个公司会给你合成TRE3G promoter啊?里面有7个TRE repeat,合成难度很大哦。 : : 9kb
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m*****z 发帖数: 1451 | 12 WPRE不是对表达量有影响吗?
删掉了差别大不大?内行的人来讲讲??
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你说的没错,这类载体的插入片段大小非常受限,一旦超过2.5kb就很难包装了,如果 : 把WPRE等其他非必需element删除的话,大致包装极限能到3.5kb的样子。 : 能合成复杂重复序列的公司还是有的,稍微贵点儿而已。
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s*********s 发帖数: 110 | 13 用Adeno
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你说的没错,这类载体的插入片段大小非常受限,一旦超过2.5kb就很难包装了,如果 : 把WPRE等其他非必需element删除的话,大致包装极限能到3.5kb的样子。 : 能合成复杂重复序列的公司还是有的,稍微贵点儿而已。
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j****x 发帖数: 1704 | 14 对于Tet-one系统,WPRE本身就不是调控你的target gene的,而是放在了resistance
gene和Tet-on 3G的后面,这个有或没有显然就影响不大了。
【在 m*****z 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : WPRE不是对表达量有影响吗? : 删掉了差别大不大?内行的人来讲讲??
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m*****z 发帖数: 1451 | 15 的确是。不过我自己做的lenti vector把WPRE放在了target gene后面,目的就是想增
加表达量,所以才有此一问。看来还是留着比较好?600左右长的片段,加减也不会影
响滴度太多吧,我想
【在 j****x 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 对于Tet-one系统,WPRE本身就不是调控你的target gene的,而是放在了resistance : gene和Tet-on 3G的后面,这个有或没有显然就影响不大了。
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