[求助]reporter line based on Crispr - Biology版

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Biology版 - [求助]reporter line based on Crispr

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a****d
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准备建一个hESC reporter line, 有几个问题向有经验的大牛们请教。
我准备在目的gene末端插入XFP，那么在HDR之间是否应该这个顺序： last exon(stop
codon removed)-T2A-XFP-UTR？
目前在last exon上面找到了一些sgRNA序列，在stop codon上游大概50-150bp. 请问在
这个距离上double nicking是否可行？
另外选择好了sgRNA后，选择HDR是不是按照double nicking位置向上游选700-1000bp，
然后从last exon(stop codon removed)-T2A-XFP-UTR开始向下游选700-1000bp？没有
其他的特殊要求？
准备donor plasmid时，考虑到很难找到特异的酶切位点去匹配几个不同的片段，这种
几个大片段连接，是不是选择Gibson Assembly Cloning更容易一些？

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相关主题
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