m******8
发帖数: 3 | 1 有谁用PCR产物连接T载体后直接用来做下一轮PCR的模板吗？引物设计在插入片段的两
端。会不会在PCR过程中因为有nick而断裂？ |
u******r
发帖数: 1541 | 2 应该可以的
断裂的PCR放不出来，只会放大连接进去的 |
s******s
发帖数: 13035 | 3 太多了，没问题
【在 m******8 的大作中提到】
: 有谁用PCR产物连接T载体后直接用来做下一轮PCR的模板吗？引物设计在插入片段的两
: 端。会不会在PCR过程中因为有nick而断裂？
|
j****n
发帖数: 3370 | 4 技术上没问题
运气不好 要是有些template有mutation 不就挂了？
做ta cloning的目的之一就是sequencing吧？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 m******8 的大作中提到】
: 有谁用PCR产物连接T载体后直接用来做下一轮PCR的模板吗？引物设计在插入片段的两
: 端。会不会在PCR过程中因为有nick而断裂？
|
j****n
发帖数: 3370 | 5 我记得很多年前 刚接触分子克隆的时候
老板说的第一句话就是禁止用pcr产物做下一轮pcr template
貌似你这个也差不多吧？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 m******8 的大作中提到】
: 有谁用PCR产物连接T载体后直接用来做下一轮PCR的模板吗？引物设计在插入片段的两
: 端。会不会在PCR过程中因为有nick而断裂？
|
e****s
发帖数: 1125 | 6 你老板这么说依据是啥？感觉不科学。
我反正动不动就拿PCR产物进一步扩增。
【在 j****n 的大作中提到】
: 我记得很多年前 刚接触分子克隆的时候
: 老板说的第一句话就是禁止用pcr产物做下一轮pcr template
: 貌似你这个也差不多吧？
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
|
j****n
发帖数: 3370 | 7 Mutation 而且pcr过程会被放大
如果target gene表达会导致细胞毒性，mutation在进一步被富集。。。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 e****s 的大作中提到】
: 你老板这么说依据是啥？感觉不科学。
: 我反正动不动就拿PCR产物进一步扩增。
|
t*****z
发帖数: 1598 | 8 如果还用原来的引物，是扩不出来的。要用nested primers。
【在 e****s 的大作中提到】
: 你老板这么说依据是啥？感觉不科学。
: 我反正动不动就拿PCR产物进一步扩增。
|
j****n
发帖数: 3370 | 9 ？还有这问题？不太可能吧 哈哈
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 t*****z 的大作中提到】
: 如果还用原来的引物，是扩不出来的。要用nested primers。
|
t*****z
发帖数: 1598 | 10 这是我自己的经验。
【在 j****n 的大作中提到】
: ？还有这问题？不太可能吧 哈哈
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
|
|
|
j****n
发帖数: 3370 | 11 个别例子 还是？
我们做OE-pcr 一般都没用新的primer
也没出过啥问题。。。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 t*****z 的大作中提到】
: 这是我自己的经验。
|
t*****z
发帖数: 1598 | 12 我是做MLST，用的是普通Taq酶，我试验过几个基因和几组引物都不行，一点点产物都
没有。
OE-PCR，如果我理解没错的话，用的不是原来的引物，而是跟原来互补的引物吧？
【在 j****n 的大作中提到】
: 个别例子 还是？
: 我们做OE-pcr 一般都没用新的primer
: 也没出过啥问题。。。
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
|
j****n
发帖数: 3370 | 13 我们都是直接用fragment1-F 和fragment2-R 貌似也没出过啥问题
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
【在 t*****z 的大作中提到】
: 我是做MLST，用的是普通Taq酶，我试验过几个基因和几组引物都不行，一点点产物都
: 没有。
: OE-PCR，如果我理解没错的话，用的不是原来的引物，而是跟原来互补的引物吧？
|
t*****z
发帖数: 1598 | 14 你试试fragment1-F和fragment1-R，看看会怎样？
【在 j****n 的大作中提到】
: 我们都是直接用fragment1-F 和fragment2-R 貌似也没出过啥问题
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
|
b*********e
发帖数: 870 | 15 nested primer 更好。但是原本的primer也是可以扩出来的。可以换不同的酶试试，各
个公司差很多，而且对于扩增的片段大小不同，各个酶也不太一样。
我比较喜欢用clontech 的 primestar HS。
【在 t*****z 的大作中提到】
: 如果还用原来的引物，是扩不出来的。要用nested primers。
|
t*****z
发帖数: 1598 | 16 这样啊，看来是我的PCR条件太不够优化了，呵呵呵
【在 b*********e 的大作中提到】
: nested primer 更好。但是原本的primer也是可以扩出来的。可以换不同的酶试试，各
: 个公司差很多，而且对于扩增的片段大小不同，各个酶也不太一样。
: 我比较喜欢用clontech 的 primestar HS。
|
