h**********r
发帖数: 671 | 1 做一个基因的knockout,加两端同源臂到loxp-ura3-loxp，转化，挑克隆，提DNA，用
PCR鉴定。问题是上游片段能扩增出来（一个引物在5' flank用于做construct之外,反
向引物在ura3之内），然后下游片段（一个引物在3' flank用于做construct之外,正向
引物在ura3之内）怎么都不work。试了好几个克隆，也换了primer.别的基因knockout
都没问题。按道理上游能扩出来，就表明基因被knockout了。想double check,结果下
游就死活不work.
请教大家可能的原因。多谢！ | s******y
发帖数: 28562 | 2 估计是下游有比较古怪的二级结构。建议加大DMSO的量，或者换一个Taq polymerase
knockout
【在 h**********r 的大作中提到】
: 做一个基因的knockout,加两端同源臂到loxp-ura3-loxp，转化，挑克隆，提DNA，用
: PCR鉴定。问题是上游片段能扩增出来（一个引物在5' flank用于做construct之外,反
: 向引物在ura3之内），然后下游片段（一个引物在3' flank用于做construct之外,正向
: 引物在ura3之内）怎么都不work。试了好几个克隆，也换了primer.别的基因knockout
: 都没问题。按道理上游能扩出来，就表明基因被knockout了。想double check,结果下
: 游就死活不work.
: 请教大家可能的原因。多谢！
| z*******n
发帖数: 101 | 3 用上游construct 外的primer和下游construct 外primer pcr 和control 比看size 变
化，要是p 不出来就是下游引物有问题 | h**********r
发帖数: 671 | 4 因为ura3和要knockout的基因size差不多，所以不太好比。准备把ura3去掉之后，直接
比size. |
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