c*********r
发帖数: 181 | 1 以前曾经能够P出结果的实验，现在不行了。
所有可能的试剂原因都分析过了，找不出原因。
我的问题可能对版上各位大牛来说太SIMPLE，请大家不吝指点。
谢谢！ |
c*********r
发帖数: 181 | 2 我不会贴图片上来，抱歉了，否则可以把实验结果贴上来。如果需要，我可以想法把图
片发给各位大侠，请多帮忙呀。 |
s*******2
发帖数: 598 | 3 改变条件；增加循环
改变配方比例，
从新设计选择新的Ｐｒｉｍｅｒ |
x********e
发帖数: 35261 | 4 用什么做的模板？有没有可以作为positive ctrl的模板？
【在 c*********r 的大作中提到】
: 以前曾经能够P出结果的实验，现在不行了。
: 所有可能的试剂原因都分析过了，找不出原因。
: 我的问题可能对版上各位大牛来说太SIMPLE，请大家不吝指点。
: 谢谢！
|
H*g
发帖数: 2333 | 5 Have you included a positive control in your PCR? Also a negative control
too.
【在 c*********r 的大作中提到】
: 以前曾经能够P出结果的实验，现在不行了。
: 所有可能的试剂原因都分析过了，找不出原因。
: 我的问题可能对版上各位大牛来说太SIMPLE，请大家不吝指点。
: 谢谢！
|
c*****u
发帖数: 439 | 6 如果是有非特异的杂带的话
减少 模版 减少 primer 减少dntp 加一点dmso |
m******u
发帖数: 12400 | 7 check water. Usually that is the last component that is often ignored by
people. |
T*****e
发帖数: 247 | |
D*a
发帖数: 6830 | 9 什么叫不行了？没有图也可以描述啊。。。或者google下如何贴图 |
s******s
发帖数: 13035 | 10 说对了。有一次，实验室滤水器报警坏了，一个有机物过滤失效了没有发现。
足足花了4个月debug啊，所以试剂从头到尾换，包括pcr仪器，就是做不出啊
【在 m******u 的大作中提到】
: check water. Usually that is the last component that is often ignored by
: people.
|
|
|
x********e
发帖数: 35261 | 11 这个用commercial的水就好了。很多试剂盒都带的
【在 s******s 的大作中提到】
: 说对了。有一次，实验室滤水器报警坏了，一个有机物过滤失效了没有发现。
: 足足花了4个月debug啊，所以试剂从头到尾换，包括pcr仪器，就是做不出啊
|
s******s
发帖数: 13035 | 12 想不到啊。而且那水做其他实验没问题
【在 x********e 的大作中提到】
: 这个用commercial的水就好了。很多试剂盒都带的
|
x********e
发帖数: 35261 | 13 你是P不出东西？
我要是以前做得出的实验不work，会把所有reagent都换了再试一遍
【在 s******s 的大作中提到】
: 想不到啊。而且那水做其他实验没问题
|
s******s
发帖数: 13035 | 14 对呀。所有东西全换，包括水。问题是新水也是同一个装置过滤出来的，
所以老是不行，惨死
【在 x********e 的大作中提到】
: 你是P不出东西？
: 我要是以前做得出的实验不work，会把所有reagent都换了再试一遍
|
x********e
发帖数: 35261 | 15 我做PCR对水很小心，最担心水被污染。一般我用过滤的水，autoclave一大瓶，然后
aliquot出来用。其实做PCR，只要某reagent换了做不出，就肯定是那个reagent的问题
。buffer啊酶啊都不太可能出问题。最容易出问题的就是水和模版。
【在 s******s 的大作中提到】
: 对呀。所有东西全换，包括水。问题是新水也是同一个装置过滤出来的，
: 所以老是不行，惨死
|
c*********r
发帖数: 181 | 16 多谢大家的热情帮助。
我现在是P出了一片亮光，但是换过了别的引物就没有问题。
所以重新合成了引物，但是还是不行。
我有点怀疑是PCR管的问题，正在换管重新做实验。
期待ing。。。。。
应该不是水的问题，我的水都是灭菌后分装很多，冻存在-20。每次取一管用，而且换
别的引物是可以P出来的。
不知道能否给大家说清楚问题了。
PCR仪器的问题也排除了，因为是新机器，而且也换不同仪器了。 |
x********e
发帖数: 35261 | 17 实验设计还是有问题啊
如果是pcr管有问题，其他的也p不出吧。p的时候一定要加一个正对照，检验证明试剂
，管子和仪器都正常。模板可能有问题。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 多谢大家的热情帮助。
: 我现在是P出了一片亮光，但是换过了别的引物就没有问题。
: 所以重新合成了引物，但是还是不行。
: 我有点怀疑是PCR管的问题，正在换管重新做实验。
: 期待ing。。。。。
: 应该不是水的问题，我的水都是灭菌后分装很多，冻存在-20。每次取一管用，而且换
: 别的引物是可以P出来的。
: 不知道能否给大家说清楚问题了。
: PCR仪器的问题也排除了，因为是新机器，而且也换不同仪器了。
|
D*a
发帖数: 6830 | 18 一片亮光。。。在marker的大概什么位置？
pcr也多了，你做pcr是什么？
换模版的话引物能不能用呢？
不是我说，你这两个帖子写得。。。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 多谢大家的热情帮助。
: 我现在是P出了一片亮光，但是换过了别的引物就没有问题。
: 所以重新合成了引物，但是还是不行。
: 我有点怀疑是PCR管的问题，正在换管重新做实验。
: 期待ing。。。。。
: 应该不是水的问题，我的水都是灭菌后分装很多，冻存在-20。每次取一管用，而且换
: 别的引物是可以P出来的。
: 不知道能否给大家说清楚问题了。
: PCR仪器的问题也排除了，因为是新机器，而且也换不同仪器了。
|
g***j
发帖数: 40861 | |
g***j
发帖数: 40861 | |
|
|
c*********r
发帖数: 181 | 21 多谢大家指点。我的分子生物学确实做得少，博士毕业了才开始做分子生物学，可能表
述也不清楚。
我做PCR一般都没有对照，不管是阳性还是阴性。
模板我也怀疑有问题，已经换过了，但是还是不出结果，没办法。
跟我们做分子生物学的同事也讨论过了，他们也找不出原因，所以我已经拿给公司做了
，希望有结果。上帝保佑！
最近的实验好痛苦，ANYWAY，谢谢大家的热情帮助，如果有后续结果，我希望我能记得
来给大家汇报一下。 |
x********e
发帖数: 35261 | 22 都博士毕业了还不知道做实验要有对照。。。你没对照怎么troubleshooting啊
【在 c*********r 的大作中提到】
: 多谢大家指点。我的分子生物学确实做得少，博士毕业了才开始做分子生物学，可能表
: 述也不清楚。
: 我做PCR一般都没有对照，不管是阳性还是阴性。
: 模板我也怀疑有问题，已经换过了，但是还是不出结果，没办法。
: 跟我们做分子生物学的同事也讨论过了，他们也找不出原因，所以我已经拿给公司做了
: ，希望有结果。上帝保佑！
: 最近的实验好痛苦，ANYWAY，谢谢大家的热情帮助，如果有后续结果，我希望我能记得
: 来给大家汇报一下。
|
c*********r
发帖数: 181 | 23 我老板是学化学的出身，所以我们实验室基本不做分子生物学的东西，如果需要做，都
是请别的老师帮忙做。
解释一下。
再次感谢大家帮忙。
我把样品发到上海一家公司代做，马上就出结果了，带很亮，结果很好。
目前我也不知道该咋解释这个情况。 |
