c*********r 发帖数: 181 | 1 以前曾经能够P出结果的实验,现在不行了。
所有可能的试剂原因都分析过了,找不出原因。
我的问题可能对版上各位大牛来说太SIMPLE,请大家不吝指点。
谢谢! |
c*********r 发帖数: 181 | 2 我不会贴图片上来,抱歉了,否则可以把实验结果贴上来。如果需要,我可以想法把图
片发给各位大侠,请多帮忙呀。 |
s*******2 发帖数: 598 | 3 改变条件;增加循环
改变配方比例,
从新设计选择新的Primer |
x********e 发帖数: 35261 | 4 用什么做的模板?有没有可以作为positive ctrl的模板?
【在 c*********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 以前曾经能够P出结果的实验,现在不行了。 : 所有可能的试剂原因都分析过了,找不出原因。 : 我的问题可能对版上各位大牛来说太SIMPLE,请大家不吝指点。 : 谢谢!
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H*g 发帖数: 2333 | 5 Have you included a positive control in your PCR? Also a negative control
too.
【在 c*********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 以前曾经能够P出结果的实验,现在不行了。 : 所有可能的试剂原因都分析过了,找不出原因。 : 我的问题可能对版上各位大牛来说太SIMPLE,请大家不吝指点。 : 谢谢!
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c*****u 发帖数: 439 | 6 如果是有非特异的杂带的话
减少 模版 减少 primer 减少dntp 加一点dmso |
m******u 发帖数: 12400 | 7 check water. Usually that is the last component that is often ignored by
people. |
T*****e 发帖数: 247 | |
D*a 发帖数: 6830 | 9 什么叫不行了?没有图也可以描述啊。。。或者google下如何贴图 |
s******s 发帖数: 13035 | 10 说对了。有一次,实验室滤水器报警坏了,一个有机物过滤失效了没有发现。
足足花了4个月debug啊,所以试剂从头到尾换,包括pcr仪器,就是做不出啊
【在 m******u 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : check water. Usually that is the last component that is often ignored by : people.
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x********e 发帖数: 35261 | 11 这个用commercial的水就好了。很多试剂盒都带的
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 说对了。有一次,实验室滤水器报警坏了,一个有机物过滤失效了没有发现。 : 足足花了4个月debug啊,所以试剂从头到尾换,包括pcr仪器,就是做不出啊
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s******s 发帖数: 13035 | 12 想不到啊。而且那水做其他实验没问题
【在 x********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 这个用commercial的水就好了。很多试剂盒都带的
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x********e 发帖数: 35261 | 13 你是P不出东西?
我要是以前做得出的实验不work,会把所有reagent都换了再试一遍
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 想不到啊。而且那水做其他实验没问题
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s******s 发帖数: 13035 | 14 对呀。所有东西全换,包括水。问题是新水也是同一个装置过滤出来的,
所以老是不行,惨死
【在 x********e 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 你是P不出东西? : 我要是以前做得出的实验不work,会把所有reagent都换了再试一遍
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x********e 发帖数: 35261 | 15 我做PCR对水很小心,最担心水被污染。一般我用过滤的水,autoclave一大瓶,然后
aliquot出来用。其实做PCR,只要某reagent换了做不出,就肯定是那个reagent的问题
。buffer啊酶啊都不太可能出问题。最容易出问题的就是水和模版。
【在 s******s 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 对呀。所有东西全换,包括水。问题是新水也是同一个装置过滤出来的, : 所以老是不行,惨死
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c*********r 发帖数: 181 | 16 多谢大家的热情帮助。
我现在是P出了一片亮光,但是换过了别的引物就没有问题。
所以重新合成了引物,但是还是不行。
我有点怀疑是PCR管的问题,正在换管重新做实验。
期待ing。。。。。
应该不是水的问题,我的水都是灭菌后分装很多,冻存在-20。每次取一管用,而且换
别的引物是可以P出来的。
不知道能否给大家说清楚问题了。
PCR仪器的问题也排除了,因为是新机器,而且也换不同仪器了。 |
x********e 发帖数: 35261 | 17 实验设计还是有问题啊
如果是pcr管有问题,其他的也p不出吧。p的时候一定要加一个正对照,检验证明试剂
,管子和仪器都正常。模板可能有问题。
【在 c*********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 多谢大家的热情帮助。 : 我现在是P出了一片亮光,但是换过了别的引物就没有问题。 : 所以重新合成了引物,但是还是不行。 : 我有点怀疑是PCR管的问题,正在换管重新做实验。 : 期待ing。。。。。 : 应该不是水的问题,我的水都是灭菌后分装很多,冻存在-20。每次取一管用,而且换 : 别的引物是可以P出来的。 : 不知道能否给大家说清楚问题了。 : PCR仪器的问题也排除了,因为是新机器,而且也换不同仪器了。
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D*a 发帖数: 6830 | 18 一片亮光。。。在marker的大概什么位置?
pcr也多了,你做pcr是什么?
换模版的话引物能不能用呢?
不是我说,你这两个帖子写得。。。
【在 c*********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 多谢大家的热情帮助。 : 我现在是P出了一片亮光,但是换过了别的引物就没有问题。 : 所以重新合成了引物,但是还是不行。 : 我有点怀疑是PCR管的问题,正在换管重新做实验。 : 期待ing。。。。。 : 应该不是水的问题,我的水都是灭菌后分装很多,冻存在-20。每次取一管用,而且换 : 别的引物是可以P出来的。 : 不知道能否给大家说清楚问题了。 : PCR仪器的问题也排除了,因为是新机器,而且也换不同仪器了。
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g***j 发帖数: 40861 | |
g***j 发帖数: 40861 | |
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c*********r 发帖数: 181 | 21 多谢大家指点。我的分子生物学确实做得少,博士毕业了才开始做分子生物学,可能表
述也不清楚。
我做PCR一般都没有对照,不管是阳性还是阴性。
模板我也怀疑有问题,已经换过了,但是还是不出结果,没办法。
跟我们做分子生物学的同事也讨论过了,他们也找不出原因,所以我已经拿给公司做了
,希望有结果。上帝保佑!
最近的实验好痛苦,ANYWAY,谢谢大家的热情帮助,如果有后续结果,我希望我能记得
来给大家汇报一下。 |
x********e 发帖数: 35261 | 22 都博士毕业了还不知道做实验要有对照。。。你没对照怎么troubleshooting啊
【在 c*********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 多谢大家指点。我的分子生物学确实做得少,博士毕业了才开始做分子生物学,可能表 : 述也不清楚。 : 我做PCR一般都没有对照,不管是阳性还是阴性。 : 模板我也怀疑有问题,已经换过了,但是还是不出结果,没办法。 : 跟我们做分子生物学的同事也讨论过了,他们也找不出原因,所以我已经拿给公司做了 : ,希望有结果。上帝保佑! : 最近的实验好痛苦,ANYWAY,谢谢大家的热情帮助,如果有后续结果,我希望我能记得 : 来给大家汇报一下。
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c*********r 发帖数: 181 | 23 我老板是学化学的出身,所以我们实验室基本不做分子生物学的东西,如果需要做,都
是请别的老师帮忙做。
解释一下。
再次感谢大家帮忙。
我把样品发到上海一家公司代做,马上就出结果了,带很亮,结果很好。
目前我也不知道该咋解释这个情况。 |