s********r
发帖数: 312 | 1 如果用surveyor assay的话会不会很贵？PCR产物直接做，还是要用96-well
purification kit再过一遍？ 不同孔的DNA浓度怎么normalize？
另外好像以前听说过可以用Taqman做realtime PCR based point mutation detection,
这个有成熟的方法么？
谢谢！ | x********e
发帖数: 35261 | 2 你不放质粒里再筛？
detection,
【在 s********r 的大作中提到】
: 如果用surveyor assay的话会不会很贵？PCR产物直接做，还是要用96-well
: purification kit再过一遍？ 不同孔的DNA浓度怎么normalize？
: 另外好像以前听说过可以用Taqman做realtime PCR based point mutation detection,
: 这个有成熟的方法么？
: 谢谢！
| s********r
发帖数: 312 | 3 我可能没说清楚。96孔板里是挑的细胞 single colony。我想从里面筛到到genomic
DNA上带那个突变的细胞系。
【在 x********e 的大作中提到】
: 你不放质粒里再筛？
:
: detection,
| x********e
发帖数: 35261 | 4 直接做genomic PCR啊
如果是random mutation的话我知道有人用realtime pcr去screen TALEN mutant
如果是有target的话，比如CRISPR，我身边也有人直接设计target site的primer，然后
普通pcr就筛出来了
听听其他有经验的同学怎么说
【在 s********r 的大作中提到】
: 我可能没说清楚。96孔板里是挑的细胞 single colony。我想从里面筛到到genomic
: DNA上带那个突变的细胞系。
| s*****g
发帖数: 87 | 5 可以用digital PCR,参见下文。
Isolation of single-base genome-edited human iPS cells without antibiotic
selection
Yuichiro Miyaoka, Amanda H Chan, Luke M Judge, Jennie Yoo, Miller Huang,
Trieu D Nguyen, Paweena P Lizarraga, Po-Lin So & Bruce R Conklin
Nature Methods 11, 291–293 (2014) doi:10.1038/nmeth.2840 | s********r
发帖数: 312 | 6 这个有点厉害，多谢了。。
【在 s*****g 的大作中提到】
: 可以用digital PCR,参见下文。
: Isolation of single-base genome-edited human iPS cells without antibiotic
: selection
: Yuichiro Miyaoka, Amanda H Chan, Luke M Judge, Jennie Yoo, Miller Huang,
: Trieu D Nguyen, Paweena P Lizarraga, Po-Lin So & Bruce R Conklin
: Nature Methods 11, 291–293 (2014) doi:10.1038/nmeth.2840
| C*********h
发帖数: 83 | 7 在点突变位点做同义突变。
然后可以设计合适的引物做PCR。
只有KI进去之后才能PCR出来。
可以批量做。
detection,
【在 s********r 的大作中提到】
: 如果用surveyor assay的话会不会很贵？PCR产物直接做，还是要用96-well
: purification kit再过一遍？ 不同孔的DNA浓度怎么normalize？
: 另外好像以前听说过可以用Taqman做realtime PCR based point mutation detection,
: 这个有成熟的方法么？
: 谢谢！
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