p*******i 发帖数: 449 | 1 最近在用CRISPR来删除一部分基因组,就在试验细胞系上成功地看到一次正确的删除。
其他目的细胞系尝试全部都是未删除。具体就不说了,只说一个问题:
我使用下列两个CRISPR来做double strand break. 两个CUT之间不想引入任何序列。然
后通过系列稀释和PCR筛选正确的删除细胞克隆。
CRISPR1 gRNA特异部分: XXXXXXXXXXXXXXXXXGT()TAA
CRISPR2 gRNA特异部分: XXXXXXXXXXXXXXXXXAG()TAA
具体序列保密,不方便透露。 两CRISPR相距400bp. 括弧是double strand break位点。
我发现重组修复后,如果精确剪切和连接,会产生一个完全相同的CRISPR位点。 如果
我做的是瞬转, 这个位点会不会再次被“CRISPR1"识别和剪切? 如果如此,是不是大
大降低了我得到正确克隆的可能性?是不是可以解释为什么我重复4 5次,筛几百克隆
无一正确的原因?
请大家讨论指教,非常非常感谢! |
H****N 发帖数: 997 | 2 "我发现重组修复后,如果精确剪切和连接,会产生一个完全相同的CRISPR位点"
这种可能性非常小吧, 因为剪切后,连接前,总会有些碱基被削掉 |
p*******i 发帖数: 449 | 3 “这种可能性非常小吧, 因为剪切后,连接前,总会有些碱基被削掉"
谢谢楼上的热心解答,您的意思,精确剪切和连接几率很小,大部分还是在切点附近有
碱基增减? |
j******i 发帖数: 939 | 4 不正确的克隆是什么样子的?删除一段序列应该不难,但cut之后的非同源重组修复是
不精确的。如果你想得到精确的修复,我觉得应该用加donor同源重组的方法。 |
d****u 发帖数: 1553 | 5 CRISPR引起的DSB是由NHEJ来修理的,这个过程应该说是超级的不精确,删除的碱基数
从几个到10几个到几十个不等。你这个精确剪切的概率应该是非常非常低的。 |
H****N 发帖数: 997 | 6 yes.碱基只会减不会增。 看其他人的回答
【在 p*******i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : “这种可能性非常小吧, 因为剪切后,连接前,总会有些碱基被削掉" : 谢谢楼上的热心解答,您的意思,精确剪切和连接几率很小,大部分还是在切点附近有 : 碱基增减?
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p*******i 发帖数: 449 | 7 非常感谢各位的解答指点。
我太喜欢这个不精确的修剪了。 谢谢各位,我可以继续放心去筛了。我以为我需要修
改其中一个CRISPR的序列。
分子生物学的东西博大精深啊,我这种就知道个皮毛的纯生化出身,真是放眼四处皆学
问啊。 |
Q********i 发帖数: 4 | 8 用过张峰Lab的lenticrispr,效果不错,关键是要挑单克隆
QLJI |
s******y 发帖数: 28562 | 9 好奇的求问一下:需要全细胞测序来确认被切的位点么?
【在 Q********i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 用过张峰Lab的lenticrispr,效果不错,关键是要挑单克隆 : QLJI
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s********r 发帖数: 312 | 10 这个嘛,要看你自己在不在乎了,可以分为三个等级:
1.就想看看phenotype,根本不care off-target,那就只PCR测序target位点。
2.其实不是很care,但是为了发文章,假装care一下,就把预测的几个off-target测一下
3.钱多,干脆能做的都做了再说,那就直接全测
【在 s******y 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 好奇的求问一下:需要全细胞测序来确认被切的位点么?
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m*****z 发帖数: 1451 | 11 筛了几百个了?好歹做个PCR看看整个pool里面有没有deletion吧
点。
【在 p*******i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 最近在用CRISPR来删除一部分基因组,就在试验细胞系上成功地看到一次正确的删除。 : 其他目的细胞系尝试全部都是未删除。具体就不说了,只说一个问题: : 我使用下列两个CRISPR来做double strand break. 两个CUT之间不想引入任何序列。然 : 后通过系列稀释和PCR筛选正确的删除细胞克隆。 : CRISPR1 gRNA特异部分: XXXXXXXXXXXXXXXXXGT()TAA : CRISPR2 gRNA特异部分: XXXXXXXXXXXXXXXXXAG()TAA : 具体序列保密,不方便透露。 两CRISPR相距400bp. 括弧是double strand break位点。 : 我发现重组修复后,如果精确剪切和连接,会产生一个完全相同的CRISPR位点。 如果 : 我做的是瞬转, 这个位点会不会再次被“CRISPR1"识别和剪切? 如果如此,是不是大 : 大降低了我得到正确克隆的可能性?是不是可以解释为什么我重复4 5次,筛几百克隆
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m*****z 发帖数: 1451 | 12 就算发生了再次剪切,也不会把已经delete掉的片段修复回去,你的担心是多余的。看
你描述应该是cutting efficiency太低,找找原因吧,埋头苦筛跟买彩票有啥区别?
【在 p*******i 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png) : 非常感谢各位的解答指点。 : 我太喜欢这个不精确的修剪了。 谢谢各位,我可以继续放心去筛了。我以为我需要修 : 改其中一个CRISPR的序列。 : 分子生物学的东西博大精深啊,我这种就知道个皮毛的纯生化出身,真是放眼四处皆学 : 问啊。
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