b**********8
发帖数: 349 | 1 各位战友，大家好，最近试验中遇到，siRNA处理细胞之后，荧光定量pcr有70-90%的干
扰效率，但是wb却始终验证不了其knockdown的效果，已经换了几支抗体了（n-
terminal or c-terminal）。siRNA处理细胞之后，下游的表型变化很明显，比如说凋
亡，增殖，迁移等。
但是目的蛋白的knockdown无法验证，很是头痛，请大家支招有什么办法解决。谢谢！ |
f******g
发帖数: 1003 | 2 wait and see, it will take sometime for protein degradation |
b**********8
发帖数: 349 | 3 谢谢回复，但是蛋白已经是在转染siRNA之后第4天收的，时间应该已经够了吧？
另外，万一从WB水平实在无法证实siRNA的敲减效果，但是RT-PCR能够证实，在细胞株
上也做了一堆功能和表型，也有相关的机制探索，能发文章吗？怎么在文章中解决WB的
问题？
【在 f******g 的大作中提到】
: wait and see, it will take sometime for protein degradation
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f******g
发帖数: 1003 | 4 better have western result, RT-PCR result is not reliable.
【在 b**********8 的大作中提到】
: 谢谢回复，但是蛋白已经是在转染siRNA之后第4天收的，时间应该已经够了吧？
: 另外，万一从WB水平实在无法证实siRNA的敲减效果，但是RT-PCR能够证实，在细胞株
: 上也做了一堆功能和表型，也有相关的机制探索，能发文章吗？怎么在文章中解决WB的
: 问题？
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i*********0
发帖数: 915 | 5 实不行的话，quantify一下band，有的时候20%的KD效率（蛋白水平）就有细胞学
effect了。多来几条siRNA，如果结果一致的话，也可以说明问题。
有些gene，如果100%的KD以后，细胞就死了，artifact也会太多，用这种实验来解释生
物学现象，反而不可靠。 |
v***a
发帖数: 1242 | 6 先IP再WB？
【在 b**********8 的大作中提到】
: 各位战友，大家好，最近试验中遇到，siRNA处理细胞之后，荧光定量pcr有70-90%的干
: 扰效率，但是wb却始终验证不了其knockdown的效果，已经换了几支抗体了（n-
: terminal or c-terminal）。siRNA处理细胞之后，下游的表型变化很明显，比如说凋
: 亡，增殖，迁移等。
: 但是目的蛋白的knockdown无法验证，很是头痛，请大家支招有什么办法解决。谢谢！
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i******1
发帖数: 21 | 7 1. RNA level check: 1) to make sure the real-time rt-PCR resulst are
specific, using >=2 unique sequences of your target transcript in the
presence of proper controls than unambiguously tell quantification accuracy
and amplification specificity. 2) see how many isoforms in your cell line;
are they in similar lengths; do they share the sequence that can be targeted
by your all your siRNAs? is it possible that the one that cannot be knocked
down have predominant abundance and it it functionally negative?
2. Protein level check: to make sure the band on WB is your specific band.
Blast the epitope to see similar proteins with the same region. If not, then
protein ID by mass spectrometry.
3. Function check: overexpress the protein without functional domain (
deletions, mutations or truncations) to compete with its endogenous level to
see if similar phenomena can be recapitulate.
4.The ultimate way: Co-IP your target protein and its downstream proteins
from your knockdown and control samples, and use mass spectrometry to
identify and quantify them. If you already saw the positive phenotype, then
their interactomes are surely different. This will also provide you
molecular mechanism. |
s******y
发帖数: 28562 | 8 首先，确认你的WB没有问题。这个对于新手是常出的问题。
第二，有些蛋白的mRNA是过量的，平时只有少量的会被翻译，其他的放着备用，在
stress response 或者细胞分裂的时候才会用上。所以你在平时来检测蛋白含量是看不
出来区别的。如果要确认这些问题，一个最简单的方法是用serum starvation --> add
back serum 的方式来激发细胞来使用大部分mRNA
【在 b**********8 的大作中提到】
: 各位战友，大家好，最近试验中遇到，siRNA处理细胞之后，荧光定量pcr有70-90%的干
: 扰效率，但是wb却始终验证不了其knockdown的效果，已经换了几支抗体了（n-
: terminal or c-terminal）。siRNA处理细胞之后，下游的表型变化很明显，比如说凋
: 亡，增殖，迁移等。
: 但是目的蛋白的knockdown无法验证，很是头痛，请大家支招有什么办法解决。谢谢！
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i******1
发帖数: 21 | 9 我靠，sunday起这么早！
add
【在 s******y 的大作中提到】
: 首先，确认你的WB没有问题。这个对于新手是常出的问题。
: 第二，有些蛋白的mRNA是过量的，平时只有少量的会被翻译，其他的放着备用，在
: stress response 或者细胞分裂的时候才会用上。所以你在平时来检测蛋白含量是看不
: 出来区别的。如果要确认这些问题，一个最简单的方法是用serum starvation --> add
: back serum 的方式来激发细胞来使用大部分mRNA
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s******y
发帖数: 28562 | 10 不早了啊？
【在 i******1 的大作中提到】
: 我靠，sunday起这么早！
:
: add
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r**********g
发帖数: 15 | 11 搭车问个问题： 我siRNA处理细胞之后，wb验证knockdown的效果很好， 但功能检测却
发现没有改变， 这是为什么
【在 b**********8 的大作中提到】
: 各位战友，大家好，最近试验中遇到，siRNA处理细胞之后，荧光定量pcr有70-90%的干
: 扰效率，但是wb却始终验证不了其knockdown的效果，已经换了几支抗体了（n-
: terminal or c-terminal）。siRNA处理细胞之后，下游的表型变化很明显，比如说凋
: 亡，增殖，迁移等。
: 但是目的蛋白的knockdown无法验证，很是头痛，请大家支招有什么办法解决。谢谢！
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s******y
发帖数: 28562 | 12 可能你那个蛋白并不直接参与你检测的那个功能。
【在 r**********g 的大作中提到】
: 搭车问个问题： 我siRNA处理细胞之后，wb验证knockdown的效果很好， 但功能检测却
: 发现没有改变， 这是为什么
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x********e
发帖数: 35261 | 13 常态
【在 r**********g 的大作中提到】
: 搭车问个问题： 我siRNA处理细胞之后，wb验证knockdown的效果很好， 但功能检测却
: 发现没有改变， 这是为什么
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i******1
发帖数: 21 | 14 Sunnyday 在哪个学校啊？
【在 s******y 的大作中提到】
: 不早了啊？
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S******9
发帖数: 2837 | 15 老板这么早到实验室
【在 s******y 的大作中提到】
: 不早了啊？
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s*****g
发帖数: 7857 | 16 是的。有的100%的KD以后，细胞就死了
有时稍微的蛋白变化，就可以有一系列下游好结果。比如减少20-30%的蛋白，细胞表现
就不一样。我也遇到过同样问题。
一般我用shRNA做。比siRNA尽管时间长点，但能持续做下去。
【在 i*********0 的大作中提到】
: 实不行的话，quantify一下band，有的时候20%的KD效率（蛋白水平）就有细胞学
: effect了。多来几条siRNA，如果结果一致的话，也可以说明问题。
: 有些gene，如果100%的KD以后，细胞就死了，artifact也会太多，用这种实验来解释生
: 物学现象，反而不可靠。
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b**********8
发帖数: 349 | 17 谢谢各位朋友的回复，特别是insider1和sunnyday提供的详细解释和建议。想请问
sunny老师，你提到的这个serum starvation --> add back serum处理应该是转染
siRNA之前还是之后呢？谢谢！ |
s******y
发帖数: 28562 | 18 当然是之后。因为这个突然用血清刺激产生的效果一般只持续几个小时。
【在 b**********8 的大作中提到】
: 谢谢各位朋友的回复，特别是insider1和sunnyday提供的详细解释和建议。想请问
: sunny老师，你提到的这个serum starvation --> add back serum处理应该是转染
: siRNA之前还是之后呢？谢谢！
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i*********0
发帖数: 915 | 19 我做个几个stable KD的cell line，下游的target 非常符合KD的的预期，但是RNA水平
变化只有30% 的down，蛋白水平20%左右的下调。
这个gene的KO是lethal的，和S phase progression有关。
【在 s*****g 的大作中提到】
: 是的。有的100%的KD以后，细胞就死了
: 有时稍微的蛋白变化，就可以有一系列下游好结果。比如减少20-30%的蛋白，细胞表现
: 就不一样。我也遇到过同样问题。
: 一般我用shRNA做。比siRNA尽管时间长点，但能持续做下去。
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i******1
发帖数: 21 | 20 it looks it was caused by something else as the off-target that you knocked
down. Did you at least 2 siRNA targeting different regions and all had the
same effect? If you just use one single siRNA and that targets the
functional domain, then other proteins in the same family with similar
function will very like have that domain and will surely be knocked down
also. It might explain the downstream effects that you observed. |
b**********8
发帖数: 349 | 21
非常感谢，我试试！
【在 s******y 的大作中提到】
: 当然是之后。因为这个突然用血清刺激产生的效果一般只持续几个小时。
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